Summary
En fremgangsmåde til fremstilling af ansigtspræparater af muscarotidarterien og aorta er beskrevet. Sådanne præparater gør det muligt at studere lokalisering af proteiner og identifikation af celletyper inden for hele vaskulærvæggen ved konfokal mikroskopi, når immunofluorescens farves med specifikke antistoffer.
Abstract
Afsnit af paraffinindlejrede væv anvendes rutinemæssigt til at studere vævshistologi og histopatologi. Det er imidlertid svært at bestemme, hvad den tredimensionelle vævsmorfologi er fra sådanne sektioner. Desuden kan de undersøgte dele af væv ikke indeholde det område i vævet, der er nødvendigt med henblik på den igangværende undersøgelse. Denne sidstnævnte begrænsning forhindrer histopatologiske undersøgelser af blodkar, da vaskulære læsioner udvikles på en fokaliseret måde. Dette kræver en metode, der gør det muligt for os at undersøge et bredt område af blodkarvæggen, fra overfladen til dybere områder. Et helt monteret ansigtspræparat af blodkar opfylder dette krav. I denne artikel vil vi demonstrere, hvordan man fremstiller ansigtspræparater af musa aorta og halspulsårer og immunofluorescens pletter dem for konfokal mikroskopi og andre typer af fluorescensbaseret billeddannelse.
Introduction
Til histopatologiske undersøgelser ved lysmikroskopi behandles tredimensionale stykker biologiske væv rutinemæssigt til paraffinindlejring efterfulgt af snitning og farvning. En vævsprøve, der har været paraffinindlejret, kan være flere millimeter i alle tre dimensioner. Men med henblik på lysmikroskopi skal den først snittes, således at lyset kan passere og derefter farves, så det tynde afsnit giver tilstrækkelig kontrast til billeddannelse. Fordi snittede prøver typisk er 5-10 μm i tykkelse, ser man kun en meget lille brøkdel af hele prøven i to dimensioner ad gangen. Det er muligt at indsamle sekventielle sektioner, og efter billeddannelse af hvert afsnit individuelt udfører computerassisteret rekonstruktion af 3D-billederne, men det er faktisk et kedeligt job. Histopatologi af blodkar, specielt til undersøgelse af patogenesen af aterosklerose, giver unikke problemer. Aterosklerose er en fokaliseret sygdom, der udvikler sigLokalt i områder hvor forstyrret blodgennemstrømning forekommer. Desuden initieres sygdommen i intima, et tyndvæv bestående af et monolag af endotelceller og ekstracellulær matrix, af store arterier. Af disse grunde er det en udfordring at lokalisere og studere tidlige læsioner ved hjælp af sektionerede blodkar, fordi man let kan gå glip af at snitte læsionen. Selvom en sektion indbefatter et sygt område, vil man kun se en 5-10 μm portion indeholdende endotelceller og andre vaskulære vægceller i medierne og adventitia.
Hele Mount en Face (udtalte end fäs) præparater giver os mulighed for at undersøge et bredt område af blodkarets overflade, såsom hele aorta fra aorta rotten helt ned til de fælles iliac arterier. Ved anvendelse af en sådan prøve farvet med specifikke antistoffer og andre specifikke prober kan man bestemme placeringen af læsioner og også hvor forskellige molekylære hændelser forekommer i endotelceller sammen med wiAtherogenese såsom ændringer i ekspression, lokalisering og posttranslationelle modifikationer af proteiner. Udover at studere atherogenese anvendes den endotelcelleform, der observeres i en-ansigtspræparater, som en indikator for det regionale tidsforbrugte blodstrømningsmønster. Sådanne data er vigtige for at studere mekanosignalering af endotelceller in situ. Til dette formål er rutinemæssige histologiske tværsnit af blodkar ikke nyttige. For vaskulær medicin og biologi er det således særlig vigtigt at erhverve en teknik til fremstilling af ansigtspræparater af blodkar, der gør det muligt for en at observere et bredt område af beholderoverfladen såvel som de dybere undergrundsarealer af fartøjet.
Som gennemgået af Jelev og Surchev 1 har vaskulære biologer udviklet forskellige metoder til at observere foringen af blodkar i ansigtet. Nogle geniale metoder blev udviklet i 1940'erne og 1950'erne. Ved hjælp af disse metoder var de Kunne studere den grundlæggende organisering af endotelceller, der linjer den indre overflade af blodkar. På grund af den måde, hvorpå disse ansigtspræparater fremstilles (den såkaldte Hautchen-metode 2 , 3 , 4 eller afskalning af beholderoverfladen 5 ) og måden prøven blev farvet på, var det ikke altid muligt at opnå uafbrudt morfologisk Information fra fartøjets overflade til de dybere områder af blodkarvæggen. Hele montering af ansigtsbeholderpræparat kombineret med immunofluorescensfarvning tillod os ikke kun at studere endotelcellemorfologi og proteinekspression og lokalisering i disse celler, men også at udvide sådanne undersøgelser til den subendoteliale region af beholdervæggen. Tidlige undersøgelser ved hjælp af blodkar og ansigtspræparater blev farvede immunoflurer begyndt at fremstå i 1980'erne 6 ,F "> 7. Med fremkomsten af laserscanning-konfokal mikroskopi og nyere mikrofonmikroskopi kan man nu opnå klare in-fokusbilleder af blodkarets vægstruktur i immunofluorescensfarvede ansigtsbeholdere samt det vaskulære netværk i levende dyr 8 , 9 , 10 , 11. Disse computerbaserede billedteknikker skaber optiske snitbilleder i fokus og ved at stable sådanne billeder kan man få rekonstruerede 3D-billeder af karvæggen og det vaskulære netværk i væv. Desuden er en Kan generere billeder af et afsnit lavet langs Z-akse i det rekonstruerede billede 12 , 13 .
I denne artikel vil vi illustrere en metode til fremstilling af en ansigtspræparater af musaorta og carotidarterien til immunfluorescerende farvning. En ansigt forberedelserKan laves, selv efter at disse fartøjer er blevet manipuleret eksperimentelt. For eksempel kan en carotisarterie ligeres delvist og derefter et ansigtspræparat fremstillet efter en sådan operation. Af denne grund vil vi også i denne artikel beskrive, hvordan vi gør en partiel ligation på halspulsåren. Sammenlignet med at lave lignende præparater fra større dyr som rotter, kaniner og mennesker er musekarrene små i størrelse og mere skrøbelige og kræver således ekstra pleje for håndtering under kirurgisk isolering af kar og fremstilling af dem til antistoffarvning og mikroskopi. Fordi den mest anvendte dyremodel for genetisk modifikation er musen, bliver det kritisk for mange efterforskere at håndtere muskasser uden at skade dem. I dette manuskript beskriver vi, hvordan du håndterer museblodkar, når du fremstiller ansigtspræparater af musaorta og karotidarterie. Til demonstration vil vi bruge vildtype C57 / b6 mus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ved håndtering af museblodkar, er det vigtigt at huske, at endotelet er skrøbeligt, og at enhver overdreven mekanisk kraft vil skade endotelceller. Endotelceller kan for eksempel bryde eller løsne sig fra beholdervæggen, hvis karret bliver perfunderet for kraftigt, hvilket let kan ske, når vaskulaturen perfuseres ved hjælp af en hånddrevet sprøjte.
For at opnå konstant perfusionstryk bruger vi et tyngdekraftsperfusionssystem med et tryk på 120 cm vandkolonne. Det er blevet rapporte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterens forskningsaktiviteter understøttes af tilskud fra National Institute of Health til Dr. Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551).
Materials
| 0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500ml bag | Fisher Scientific | NC9788429 |
| 12-well plates | Fisher Scientific | 12556005 |
| 6-0 coated vicryl suture | Ethicon | J833G |
| AF488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A11006 |
| AF546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11035 |
| Anti-CD144 (Ve-Cad) | BD Biosciences | BD555289 |
| Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG | Santa Cruze Biotechnology | Sc-8304 |
| Aoto Flow System | Braintree Scientific | EZ-AF9000 |
| Autoclave Wrap. 24x24in | Cardinal Health | 4024 |
| Blunt retractors, 2.5mm wide | Fine Science Tools | 18200-10 |
| Caprofen (Rimadyl) | zoetis | NADA#141-199 |
| Chlorhexidine Scrub, 2% | Med-Vet International | RXCHLOR2-PC |
| Curity gauze sponges 2×2 | Cardinal Health | KC2146 |
| Electric heating pad, 12X14 | Fisher Scientific | NC0667724 |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 |
| Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 |
| Micro cover glass 22x50mm | VWR | 48393059 |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-18 |
| normal goat serum | Equitech-Bio | GS05 |
| Paraformaldehyde Solution 4% in PBS | Santa Cruze Biotechnology | SC-281692 |
| Petri Dishes 100x15mm | Fisher Scientific | FB0875713 |
| Prolong Gold Antifade mountant with DAPI | Life Technologies | P-36935 |
| Puritan cortton swabs | VWR | 10806-005 |
| Puritan Mini cotton tipped aplicators | VWR | 82004-050 |
| Round handled Needle Holder | Fine Science Tools | 12076-12 |
| Silk Suture 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 |
| Spring scissors | ROBOZ | RS-5601 |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14075-09 |
| Super Grip Forceps | Fine Science Tools | 00649-11 |
| Transparent Dressing | Cardinal Health | TD-26C |
| Triton X-1000 | Fisher Scientific | AC327371000 |
References
- Jelev, L., Surchev, L. A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -‘thinned-wall’ preparations. J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).
- Neill, J. F. The effect on venous endothelium of alterations in blood flow through the vessels in vein walls, and the possible relation to thrombosis. Ann Surg. 126 (3), 270-288 (1947).
- Rogers, K. A., Kalnins, V. I. A method for examining the endothelial cytoskeleton in situ using immunofluorescence. J Histochem Cytochem. 11 (11), 1317-1320 (1983).
- Poole, J. C. F., Sanders, A. G., Florey, H. W. The regeneration of aortic endothelium. J Pathol Bacteriol. 75, 133-143 (1958).
- Sade, R. M., Folkman, J. En face stripping of vascular endothelium. Microvasc Res. 4, 77-80 (1972).
- White, G. E., Gimbrone, M. A., Fujiwara, K. Factors influencing the expression of stress fibers in vascular endothelial cells in situ. J Cell Biol. 97 (2), 416-424 (1983).
- Kim, D. W., Gotlieb, A. I., Langille, B. L. In vivo modulation of endothelial F-actin microfilaments by experimental alterations in shear stress. Arteriosclero. 9, 439-445 (1989).
- Haka, A., Potteaux, S., Fraser, H., Randolph, G., Maxfield, F. Quantitative analysis of monocyte subpopulations in murine atherosclerotic plaques by multiphoton microscopy. Plos ONE. 7 (9), 244823e (2012).
- Chèvre, R., et al. High-Resolution imaging of intravascular atherogenic inflammation in live mice. Circ Res. 114, 770-779 (2014).
- Heo, K. -. S., et al. Disturbed flow-activated p90RSK kinase accelerates atherosclerosis by inhibiting SENP2 function. J Clin Invest. 125 (3), 1299-1310 (2015).
- Le, N. -. T., et al. A crucial role for p90RSK-mediated reduction of ERK5 transcriptional activity in endothelial dysfunction and atherosclerosis. Circ. 127, 486-499 (2013).
- Kano, Y., Katoh, K., Masuda, M., Fujiwara, K. Macromolecular composition of stress fiber-plasma membrane attachment sites in endothelial cells in situ. Circ Res. 79, 1000-1006 (1996).
- Nigro, P., et al. Cyclophilin A is an inflammatory mediator that promotes atherosclerosis in apolipoprotein E-dependent mice. J Exp Med. 208 (1), 53-66 (2011).
- Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. Am J Hypertens. 14 (5), 405-408 (2001).
- Jinguji, Y., Fujiwara, K. Stress fiber dependent axial organization of fibronectin fibrils in the basal lamina of the chick and mesenteric artery. Endothelium. 2, 35-47 (1994).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Lust, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluations and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Sci Rep. 6, 34331 (2016).
