माउस ब्लड वेसल्स का एन फेस तैयार करना
Summary
माउस कैरोटिड धमनी और महाधमनी के चेहरे की तैयारी के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। इस प्रकार की तैयारी, जब विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ immunofluorescence रंगा हुआ हो, तो हमें प्रोपोटिन के स्थानीयकरण और सेल प्रकार की पहचान को पूरी तरह से नाड़ी की दीवार के भीतर confocal microscopy द्वारा पढ़ने में सक्षम बनाता है।
Abstract
पैराफिन एम्बेडेड ऊतकों के अनुभाग नियमित रूप से ऊतक ऊतक विज्ञान और हिस्टोपैथोलॉजी का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, यह निर्धारित करना मुश्किल है कि तीन-आयामी ऊतक आकारिकी ऐसे वर्गों से क्या है। इसके अलावा, जांच किए गए ऊतकों के वर्गों में ऊतक के भीतर इस क्षेत्र को शामिल नहीं किया जा सकता है जो चालू अध्ययन के उद्देश्य के लिए आवश्यक है। यह बाद की सीमा रक्त वाहिकाओं के हिस्टोपैथोलॉजिकल अध्ययनों को बाधित करती है क्योंकि वास्कुलर घावों को एक फोकल रूप से विकसित किया जाता है। इसके लिए एक ऐसी विधि की आवश्यकता है जो हमें रक्त वाहिका की एक विस्तृत क्षेत्र का सर्वेक्षण करने के लिए सक्षम बनाता है, इसकी सतह से गहरी क्षेत्रों तक। रक्त वाहिकाओं की एक पूरी श्रृंखला को तैयार करना इस आवश्यकता को पूरा करता है। इस लेख में, हम दिखाएंगे कि कैसे माउस एओरोटा और कैरोटिड धमनी के चेहरे की तैयारियों को बनाने और immunofluorescently उन्हें confocal माइक्रोस्कोपी और अन्य प्रकार के प्रतिदीप्ति आधारित इमेजिंग के लिए दाग़।
Introduction
प्रकाश सूक्ष्मदर्शी द्वारा हिस्टोपैथोलॉजिकल अध्ययन के लिए, जैविक ऊतकों के तीन आयामी टुकड़े नियमित रूप से पैरालिंग के लिए अनुक्रमित और धुंधला हो जाने के बाद पैराफिन एम्बेडिंग के लिए संसाधित होते हैं। पैरासिफ़ेन-एम्बेडेड किया गया एक ऊतक नमूना सभी तीन आयामों में कई मिलीमीटर हो सकता है। हालांकि, प्रकाश माइक्रोस्कोपी के उद्देश्य के लिए, यह पहले सेक्शन किया जाना चाहिए ताकि प्रकाश पारित हो सके और फिर दाग हो ताकि पतली धारा इमेजिंग के लिए पर्याप्त विपरीत पैदा कर सकें। चूंकि खंडित नमूने आमतौर पर मोटाई में 5-10 माइक्रोन हैं, इसलिए एक समय में दो आयामों में पूरे नमूने का केवल बहुत ही छोटा अंश देखता है। प्रत्येक अनुभाग व्यक्तिगत रूप से इमेजिंग के बाद, अनुक्रमिक वर्गों को एकत्र करना संभव है, और 3 डी छवियों के कंप्यूटर-समर्थित पुनर्निर्माण करने के बाद, लेकिन यह वास्तव में एक थकाऊ काम है रक्त वाहिकाओं के हिस्टोपैथोलॉजी, विशेषकर एथेरोसलेरोसिस के रोगजनन के अध्ययन के लिए, अद्वितीय समस्याएं प्रस्तुत करता है एथ्रोस्क्लेरोसिस एक फोकली रोग है जो विकसित होती हैस्थानीय स्तर पर उन क्षेत्रों में जहां रक्त का प्रवाह बिगड़ता है। इसके अलावा, बीमारी की शुरूआत अंतःक्षेम के भीतर की जाती है, एक पतली ऊतक जिसमें बड़ी धमनियों का अंतकोशिकाय कोशिकाओं और बाह्य मैट्रिक्स शामिल होता है। इन कारणों के लिए, खंडित रक्त वाहिकाओं का उपयोग करते हुए शुरुआती घावों का पता लगाने और उनका अध्ययन करना एक चुनौती है क्योंकि एक आसानी से घावों को विभाजित कर सकता है। यहां तक कि अगर किसी अनुभाग में एक रोगग्रस्त क्षेत्र शामिल होता है, तो एक को केवल 5-10 माइक्रोन भाग मिलेगा जिसमें एन्डोथेलियल कोशिकाओं और मीडिया और एडमिटीया में अन्य संवहनी दीवार कोशिकाएं शामिल हैं।
पूरे माउंट एन चेहरे (उल्लेखित आन फास्ट) की तैयारी हमें रक्त वाहिनियों की एक विस्तृत क्षेत्र की जांच करने की अनुमति देती है जैसे कि महाधमनी जड़ से पूरे महाधमनी सभी तरह से आम iliac धमनियों के नीचे। विशिष्ट एंटीबॉडी और अन्य विशिष्ट जांच के साथ दाग वाले इस तरह के नमूने का उपयोग करते हुए, कोई भी घावों के स्थान को इंगित कर सकता है और साथ ही साथ संयोजन के अंतःथल कोशिकाओं में विभिन्न आणविक घटनाएं भी हो सकती हैं।वें एथरेोजेनेसिस जैसे कि अभिव्यक्ति में परिवर्तन, स्थानीयकरण, और प्रोटीन के पोस्ट ट्रांसलेशनलेटिक सुधार। एथरेोजेनेसिस का अध्ययन करने के अलावा, एंटीऑथेलियल सेल आकृति जो एन चेहरे की तैयारी में देखी जाती है, इसका प्रयोग क्षेत्रीय समय-औसत रक्त प्रवाह पैटर्न के सूचक के रूप में किया जाता है। सीटू में एंडोथेलियल कोशिकाओं के तंत्र-विश्लेषण का अध्ययन करने के लिए इस तरह के डेटा महत्वपूर्ण हैं। इस उद्देश्य के लिए, नियमित हिस्टोलॉजिकल क्रॉस-सेक्स्ड रक्त वाहिकाओं उपयोगी नहीं हैं। इस प्रकार, संवहनी चिकित्सा और जीव विज्ञान के लिए, रक्त वाहिकाओं के चेहरे की तैयारी करने के लिए एक तकनीक का अधिग्रहण करना विशेष रूप से महत्वपूर्ण होता है जो किसी को पोत की सतह के व्यापक क्षेत्र के साथ-साथ पोत के गहरे उपसतहों के क्षेत्र का पालन करने की अनुमति देता है।
जेवेल और सर्चेव 1 द्वारा समीक्षा के अनुसार, रक्त वाहिकाओं के चेहरे को देखने के लिए संवहनी जीवविज्ञानियों ने विभिन्न तरीकों का विकास किया है। 1 9 40 और 1 9 50 के दशक में कुछ सरल तरीके विकसित किए गए थे। इन विधियों का उपयोग करते हुए, वे थे एंडोथेलियल कोशिकाओं के मूलभूत संगठन का अध्ययन करने में सक्षम है, जो रक्त वाहिकाओं की आंतरिक सतह को रेखांकित करता है। हालांकि, जिस तरह से इन चेहरे की तैयारी तैयार की जाती है (तथाकथित हौत्चन विधि 2 , 3 , 4 या पोत की सतह 5 से छीलकर) और जिस तरह से नमूना रंगा हुआ था, उसमें निरंतर रूपात्मकता प्राप्त करने के लिए हमेशा संभव नहीं था पोत की सतह से जानकारी रक्त वाहिनियों के गहरे हिस्से में होती है। इम्योनोफ्लोरेसैंस स्टेनाइजिंग के साथ मिलकर पूरे जहाज की तैयारी के लिए हमें इन कोशिकाओं में एंडोथेलियल सेल आकृति विज्ञान और प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण का अध्ययन करने की अनुमति नहीं थी, बल्कि इस तरह के अध्ययन को पोत की दीवार के उप-क्षेत्रीय क्षेत्र में विस्तार करने की अनुमति दी गई थी। प्रारंभिक अध्ययन रक्त वाहिका और चेहरे की तैयारी का उपयोग करते हुए 1 9 80 के 6 में दिखाई देने लगे ,7. "लेजर स्कैनिंग confocal microscopy और अधिक हाल ही में multiphoton माइक्रोस्कोपी के आगमन के साथ, अब एक immunofluorescently दाग वाले चेहरे पोत के नमूनों के साथ ही जीवित जानवरों में संवहनी नेटवर्क में रक्त वाहिनियों की दीवार संरचना की स्पष्ट ध्यान केंद्रित छवियों प्राप्त कर सकते हैं 8 , 9 , 10 , 11. ये कंप्यूटर-आधारित इमेजिंग तकनीक इन-फ़ोकस ऑप्टिकल सेक्शनेड छवियां बनाती हैं, और ऐसी छवियां खड़ी करके, एक पोत की दीवारों के पुनर्संचित 3 डी छवियां और ऊतकों में संवहनी नेटवर्क प्राप्त कर सकती हैं। इसके अलावा, एक पुनर्निर्मित छवि 12 , 13 के जेड-अक्ष के साथ बनाए गए एक अनुभाग की छवियां उत्पन्न कर सकते हैं।
इस लेख में, हम माउस एरोरो की चेहरे की तैयारियों और इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला के लिए मन्या धमनी तैयार करने के लिए एक विधि को वर्णन करेंगे। चेहरा तैयारियांइन जहाजों को प्रयोगात्मक रूप से छेड़छाड़ के बाद भी बनाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक कैरोटिड धमनी आंशिक रूप से ligated हो सकता है और फिर इस तरह के एक शल्य चिकित्सा के बाद एक एन चेहरा तैयार किया जा सकता है। इस कारण से, हम इस लेख में भी वर्णन करेंगे कि हम कैरोटिड धमनी पर आंशिक रूप से कैसे बंधन करते हैं। चूहों, खरगोशों और मनुष्यों जैसे बड़े जानवरों से समान तैयारियां बनाने के मुकाबले, माउस का आकार आकार में छोटा और अधिक नाजुक है, इस प्रकार जहाजों के शल्यचिकित्सात्मक अलगाव के दौरान निपटने और एंटीबॉडी धुंधला और माइक्रोस्कोपी के लिए उन्हें तैयार करने की अतिरिक्त देखभाल की आवश्यकता होती है। चूंकि आनुवांशिक संशोधन के लिए सबसे ज्यादा इस्तेमाल किया जाने वाला पशु मॉडल माउस है, कई जांचकर्ताओं को उन्हें हानि पहुंचाए बिना माउस वाले जहाजों को संभालना महत्वपूर्ण होता है। इस पांडुलिपि में, हम यह बताएंगे कि माउस एरोरा और कैरोटिड धमनी की चेहरे की तैयारी करते हुए माउस रक्त वाहिकाओं को कैसे संभालना है। प्रदर्शन के उद्देश्य के लिए, हम जंगली प्रकार C57 / बी 6 चूहों का उपयोग करेंगे।
Protocol
Representative Results
Discussion
जब माउस रक्त वाहिकाओं को संभालते हैं, तो यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि एन्डोथेलियम नाजुक है और किसी भी अत्यधिक यांत्रिक बल से एन्डोथिलियल कोशिकाओं को नुकसान होगा। उदाहरण के लिए, पोत की दीवार से एन्डोथे?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों की अनुसंधान गतिविधियों को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान से डॉ। आबे (एचएल -130193, एचएल-123346, एचएल -118462, एचएल -108551) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया है।
Materials
| 0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500ml bag | Fisher Scientific | NC9788429 |
| 12-well plates | Fisher Scientific | 12556005 |
| 6-0 coated vicryl suture | Ethicon | J833G |
| AF488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A11006 |
| AF546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11035 |
| Anti-CD144 (Ve-Cad) | BD Biosciences | BD555289 |
| Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG | Santa Cruze Biotechnology | Sc-8304 |
| Aoto Flow System | Braintree Scientific | EZ-AF9000 |
| Autoclave Wrap. 24x24in | Cardinal Health | 4024 |
| Blunt retractors, 2.5mm wide | Fine Science Tools | 18200-10 |
| Caprofen (Rimadyl) | zoetis | NADA#141-199 |
| Chlorhexidine Scrub, 2% | Med-Vet International | RXCHLOR2-PC |
| Curity gauze sponges 2×2 | Cardinal Health | KC2146 |
| Electric heating pad, 12X14 | Fisher Scientific | NC0667724 |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 |
| Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 |
| Micro cover glass 22x50mm | VWR | 48393059 |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-18 |
| normal goat serum | Equitech-Bio | GS05 |
| Paraformaldehyde Solution 4% in PBS | Santa Cruze Biotechnology | SC-281692 |
| Petri Dishes 100x15mm | Fisher Scientific | FB0875713 |
| Prolong Gold Antifade mountant with DAPI | Life Technologies | P-36935 |
| Puritan cortton swabs | VWR | 10806-005 |
| Puritan Mini cotton tipped aplicators | VWR | 82004-050 |
| Round handled Needle Holder | Fine Science Tools | 12076-12 |
| Silk Suture 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 |
| Spring scissors | ROBOZ | RS-5601 |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14075-09 |
| Super Grip Forceps | Fine Science Tools | 00649-11 |
| Transparent Dressing | Cardinal Health | TD-26C |
| Triton X-1000 | Fisher Scientific | AC327371000 |
References
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