प्रेसिजन कटौती माउस फेफड़े स्लाइस लाइव फेफड़े वृक्ष के समान कोशिकाओं कल्पना करने के लिए
Summary
हम प्रेसिजन कटौती फेफड़े स्लाइस (PCLS) पैदा करने और उन्हें immunostaining फेफड़ों में विभिन्न प्रतिरक्षा सेल प्रकार का स्थानीयकरण कल्पना करने के लिए के लिए एक विधि का वर्णन। हमारे प्रोटोकॉल स्थिति की एक किस्म के तहत स्थान और कई अलग अलग प्रकार की कोशिकाओं के समारोह कल्पना करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।
Abstract
एलर्जी और रोगाणुओं की साँस लेना फेफड़े में प्रतिरक्षा प्रकार की कोशिकाओं की एक किस्म में अनेक परिवर्तन elicits। प्रवाह cytometry प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर कोशिका की सतह प्रोटीन के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है, लेकिन यह फेफड़ों के भीतर इन कोशिकाओं का स्थानीयकरण और प्रवास पैटर्न पर कोई जानकारी नहीं प्रदान करता है। इसी तरह, कीमोटैक्सिस assays कोशिकाओं की क्षमता का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो में कीमोटैक्टिक कारकों पर प्रतिक्रिया के लिए किया जा सकता है, लेकिन इन assays बरकरार फेफड़ों के जटिल वातावरण पुन: पेश नहीं करते। इन उपर्युक्त तकनीक के विपरीत, फेफड़ों के भीतर अलग-अलग प्रकार की कोशिकाओं के स्थान आसानी से प्रेसिजन कटौती फेफड़े स्लाइस (PCLS) पैदा करने, उन्हें व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, fluorescently टैग एंटीबॉडी के साथ धुंधला हो जाना, और कोंफोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा वर्गों visualizing द्वारा देखे जा सकते हैं। PCLS दोनों रहते हैं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और फेफड़े के ऊतकों को ठीक किया और स्लाइस बड़े जैसे क्षेत्रों धरना कर सकते हैं एक पूरी लोब के एक क्रॉस सेक्शन के रूप में। हम इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है सफलतापूर्वक फेफड़ों में प्रकार की कोशिकाओं, वृक्ष के समान कोशिकाओं की अलग-अलग प्रकार, मैक्रोफेज, neutrophils, टी कोशिकाओं और बी कोशिकाओं है, साथ ही इस तरह के लसीका, endothelial के रूप में संरचनात्मक कोशिकाओं सहित की एक विस्तृत विविधता के स्थान कल्पना करने के लिए, और उपकला कोशिकाएं। इस तरह के वृक्ष के समान कोशिकाओं और टी कोशिकाओं, लाइव, तीन आयामी फेफड़े के ऊतकों में के बीच उन लोगों के रूप में सेलुलर बातचीत, कल्पना करने के लिए की क्षमता है, पता चलता है कि कोशिकाओं फेफड़ों के भीतर ले जाने और स्थिर अवस्था में और सूजन के दौरान एक दूसरे के साथ बातचीत कर सकते हैं। इस प्रकार, जब इस तरह के फ्लो और मात्रात्मक पीसीआर के रूप में अन्य प्रक्रियाओं, के साथ संयोजन में उपयोग किया, PCLS सेलुलर घटनाओं आबाद फेफड़ों की एलर्जी और भड़काऊ रोगों की एक व्यापक समझ के लिए योगदान कर सकते हैं।
Introduction
इस तरह के lipopolysaccharide (LPS) के रूप में पूर्व-शोथ उत्तेजनाओं की साँस लेना के बाद, वहाँ, में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के एक समन्वित आंदोलन है के भीतर, और फेफड़ों से। उदाहरण के लिए, न्यूट्रोफिल तेजी से फेफड़ों पैरेन्काइमा और वायु-मार्ग के लिए भर्ती कर रहे हैं। इसके अलावा, कुछ पेशेवर प्रतिजन पेश पारंपरिक वृक्ष के समान कोशिकाओं (CDCs) के रूप में जाना कोशिकाओं एक अपेक्षाकृत जटिल प्रवास पैटर्न 1, 2 गुज़रना पड़ता है। CDCs सतह मार्कर के अपने प्रदर्शन, CD11c पर, प्रवाह cytometry का उपयोग पहचाना जा सकता है भाग में स्थित है। डीसी के विशिष्ट सबसेट CD103 और CD11b 3 के अंतर सतह अभिव्यक्ति द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता। साँस प्रतिजन प्राप्त करने पर, कुछ CDCs फेफड़ों से बाहर निकलें और फेफड़ों-खाली करने लिम्फ नोड्स (LNS) जहाँ वे पेप्टाइड्स पेश विशिष्ट प्रतिजन के लिए टी कोशिकाओं से 4 लसीका वाहिकाओं के माध्यम से विस्थापित। इस अनुकूली प्रतिरक्षा r की दीक्षा में एक महत्वपूर्ण घटना है जल्दीesponses। अज्ञात कारणों के लिए, तथापि, नहीं सभी CDCs कि साँस एंटीजन प्राप्त फेफड़ों छोड़ देते हैं, और इन कोशिकाओं के कई कई महीनों 5 के लिए उस अंग में रहते हैं 6। इस अवलोकन आंशिक रूप से इन कोशिकाओं के विकास वंश से समझाया जा सकता है क्योंकि monocyte व्युत्पन्न CD11c + केमोकाइन रिसेप्टर, CCR7 कमी कोशिकाओं, क्षेत्रीय LNS 7, 8 में माइग्रेट करने में असमर्थ हैं। यह संभावना है कि CDCs के प्रवास संभावित भी निर्धारित किया जाता है कम से कम हिस्से में, फेफड़ों के भीतर अपनी शारीरिक स्थिति के द्वारा। हालांकि, फेफड़ों में CDCs के इन अलग अलग आबादी के सटीक स्थानीयकरण विशेषता पूरी तरह से नहीं है। प्रतिरक्षा सेल स्थानीयकरण फेफड़ों के भीतर, और अणुओं है कि यह प्रत्यक्ष की के एक उन्नत ज्ञान, कैसे फेफड़ों की प्रतिरक्षा प्रणाली सक्रिय हो जाता है की एक बेहतर समझ के लिए आवश्यक है।
PCLS जा रहा है बढ़ रही हैंजबकि फेफड़ों वास्तुकला 9, 10 के संरचनात्मक अखंडता बनाए रखने ly, एक पूर्व vivo दृष्टिकोण सेलुलर स्थिति और सेल सेल बातचीत कल्पना करने के लिए के रूप में इस्तेमाल किया। PCLS चूहों, पशु, बंदरों, भेड़, घोड़े, और मनुष्यों 11 सहित कई प्रजातियों, के फेफड़ों अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इस तकनीक का एक प्रमुख लाभ यह है कि लगभग 20 स्लाइस एक माउस फेफड़ों की एक एकल पालि से तैयार किया जा सकता है, जिससे अलग-अलग प्रयोगों के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या कम है। लगभग सभी प्रतिरक्षा डीसी, मैक्रोफेज, neutrophils, और टी कोशिकाओं सहित प्रकार की कोशिकाओं,, PCLS में मौजूद हैं और अपने सामान्य संरचनाओं बनाए रखें।
PCLS भी acetylcholine 12 या methacholine 13 से इलाज के बाद कैल्शियम संकेतन और वायु-मार्ग और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की सिकुड़ना अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। इस दृष्टिकोण में, केवल फेफड़ों के एक छोटे से हिस्से एक हैमाइक्रोस्कोप alyzed, लेकिन एक शोध बताता है कि PCLS में वायु-मार्ग संकुचन की माप काट करने के लिए टुकड़ा से केवल 10% भिन्नता है, और इस विचरण बरकरार जानवरों 14 में फेफड़े की कार्यक्षमता परीक्षण का उपयोग कर देखा कि के बराबर है। अन्य जांचकर्ताओं एक पूर्व vivo दृष्टिकोण के रूप में इस्तेमाल किया है PCLS LPS 15 के साथ ऊष्मायन के बाद साइटोकाइन अभिव्यक्ति और कोशिका की सतह मार्करों में परिवर्तन का अध्ययन करने के। PCLS भी छोटे इंट्रा-कोष्ठकी धमनियों में कमी वाली फेफड़े वाहिकासंकीर्णन के एक पूर्व vivo मॉडल में इस्तेमाल किया गया है। ये पोत फेफड़ों कि विच्छेदित धमनी क्षेत्रों या subpleural वाहिकाओं 16 के विश्लेषण से रिकॉर्डिंग सहित अन्य प्रक्रियाओं का उपयोग करते हुए नहीं पहुँचा जा सकता के हिस्से में स्थित हैं। हमारी प्रयोगशाला में मुख्य रूप से इस्तेमाल किया गया है PCLS स्थिर अवस्था में रहते हैं फेफड़े के ऊतकों में प्रतिरक्षा सेल स्थानीयकरण और एक इन विवो भड़काऊ प्रोत्साहन निम्नलिखित कल्पना करने के लिए। प्रक्रियाओं हम इस बात के लिए विकसित किया है इस प्रकार हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित मूल रूप से फेफड़ों के भीतर CDCs के दो उप-समूहों के स्थानों को कल्पना करने के लिए विकसित किया गया था। हालांकि, इस प्रोटोकॉल आसानी से कई अलग अलग प्रकार की कोशिकाओं का अध्ययन करने, जबकि ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम माइक्रोस्कोपी के साथ उनकी मदद के लिए जेफ टकर, इरिका स्कैपपिनी, और एग्नेस जानोशाज़ी धन्यवाद, माउस कॉलोनी के उसके प्रबंधन के लिए लिगोन पेरो, और जून चेन और माइकल सैंडरसन ऊतक स्लाइसर साथ मदद के लिए, और माइकल फेससलर और डेरेक कैन के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए पांडुलिपि। इस काम के NIEHS, एनआईएच (जिया ES102025-09), है जो बदले में स्वास्थ्य और मानव सेवा विभाग द्वारा प्रायोजित परिसर में ही कई शाखा द्वारा वित्त पोषित किया गया।
Materials
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Prox1-TdTomato transgenic mice | Jackson Laboratory | 018128 | B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J |
| OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice | Jackson Laboratory | 004194, 006617 | B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J |
| Rag1 knock-out mice | Jackson Laboratory | 002216 | B6.129S7-Rag1tm1Mom/J |
| Ovalbumin, Low Endo, Purified | Worthington Biochemical Corporation | LS003059 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich Co. | L2630-25MG | |
| Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft | BD Diagnostic Systems | 427421 | 0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter |
| GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose | BioExpress | E-3112-125 | 2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C. |
| Compresstome VF-300 | Precisionary Instruments, Inc. | VF-300 | |
| Double Edge Stainless Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung. |
| Krazy Glue All Purpose Instant Gel | VWR | 500033-484 | Commonly available for $3/tube in local drugstores |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Normal Rat Serum | Jackson ImmunoResearch Inc. | 012-000-120 | |
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch Inc. | 015-000-120 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03HI | |
| Staining Buffer | Made in House | N/A | PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4 |
| Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies) | Made in House | N/A | Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2 |
| Anti-mouse CD11b eFluor 450 | eBioscience | 48-0112-80 | Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605 | BioLegend | 101237 | Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Phycoerythrin | eBioscience | 12-0114-82 | PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418) |
| Anti-mouse CD11c Allophycocyanin | BD Phamingen | 550261 | APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3) |
| Anti-mouse CD88 Phycoerythrin | BioLegend | 135806 | PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70) |
| Anti-mouse CD103 Allophycocyanin | eBioscience | 17-1031-82 | Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7) |
| Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450 | eBioscience | 48-0902-82 | Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1) |
| Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin | eBioscience | 17-1721-82 | Anti-mouse CD172a APC (clone: P84) |
| Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421 | BD Horizon | 564188 | BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488 | eBioscience | 53-3249-82 | Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647 | eBioscience | 51-3249-82 | Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1) |
| Glass Bottom Microwell Dishes 35mm petri dish, 14mm Microwell, No. 1.5 coverglass | MatTek Corperation | P35G-1.5-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155411PK | Pack of 16 |
| 15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness | MatTek Corperation | PCS-1.5-15 | |
| Bare Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP201 | 0.020" (0.5mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36934 | Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use. |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free | Corning | 356231 | |
| Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope | Carl Zeiss | Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss) | |
| Plan-Apochromat 20x/0.8 M27 objective lends | Carl Zeiss | 420650-9901-000 |
References
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