This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO•) probes (geNOps) to monitor single cell NO• fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO• formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.
नाइट्रिक ऑक्साइड (NO •) एक छोटे से कट्टरपंथी, जो स्तनधारी, बैक्टीरिया और पौधों में कई महत्वपूर्ण सेलुलर कार्यों मध्यस्थता करता है। Vivo में इन विट्रो में सं • पता लगाने के लिए तरीकों की एक बड़ी संख्या के अस्तित्व के बावजूद, एकल कोशिका स्तर पर कोई • की वास्तविक समय की निगरानी बहुत चुनौतीपूर्ण है। सं • के शारीरिक या रोग प्रभाव वास्तविक एकाग्रता से निर्धारित है और इस कट्टरपंथी के समय ध्यान केन्द्रित कर रहे हैं। तदनुसार तरीके नहीं • की एकल कोशिका पता लगाने की अनुमति अत्यधिक वांछनीय हैं। हाल ही में, हम एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन आधारित आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग नाइट्रिक ऑक्साइड (NO •) जांच (geNOps) जो सीधे सेलुलर सं • उतार-चढ़ाव का जवाब और, इसलिए, इस जरूरत को संबोधित शुरू करने से सं • संकेतकों के फूस का विस्तार किया। यहाँ हम geNOps का उपयोग सं • दो अलग अलग रासायनिक -liberating अणुओं के जवाब में intracellular सं • संकेतों का आकलन करने के लिए प्रदर्शित करता है। हमारे परिणाम ए एल एसओ पुष्टि करते हैं कि हौसले से तैयार 3- (2-हाइड्रोक्सी-1-मिथाइल-2-nitrosohydrazino) एन मिथाइल-1-propanamine (एनओसी-7) intracellular सं • के स्तर में परिवर्तन पैदा करने के लिए एक बहुत उच्च क्षमता है के साथ तुलना में अकार्बनिक सं • दाता सोडियम nitroprusside (एसएनपी)। इसके अलावा, दोहरी रंग रहते सेल हरी geNOps (जी geNOp) और रासायनिक सीए 2 + सूचक Fura-2 का उपयोग कर इमेजिंग सीए 2 की तंग विनियमन कल्पना करने के लिए प्रदर्शन किया गया था निर्भर सं • एकल endothelial कोशिकाओं में गठन। ये प्रतिनिधि प्रयोगों दिखाना है कि geNOps उपयुक्त उपकरण विविध प्रयोगात्मक setups में वास्तविक समय पीढ़ी और एकल कोशिका सं • संकेतों की गिरावट जांच करने के लिए कर रहे हैं।
हमने हाल ही में, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट सं • जांच के लिए एक उपन्यास वर्ग का विकास किया है geNOps 1 कहा जाता है। ये सेंसर एक बस बनाया, बैक्टीरिया व्युत्पन्न, सं • बाध्यकारी डोमेन 2, जो एक विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रोटीन संयुग्मित है (एफपी) संस्करण 3 (सियान, हरे या नारंगी एफपी) से मिलकर बनता है। कोई geNOps भीतर गैर-हीम आयरन (II) केंद्र 4 के लिए बाध्य • तुरन्त प्रतिदीप्ति तीव्रता 1 कम करता है। महत्वपूर्ण बात है, geNOps प्रतिदीप्ति तेजी से और पूरी तरह से ठीक हो जाए intracellular सं • स्तरों से गिरावट जब 1। तदनुसार, geNOps (उप) सेलुलर सं • उतार चढ़ाव के वास्तविक समय इमेजिंग अनुमति देते हैं। हालांकि कोई • संवेदन geNOps की व्यवस्था अब तक अस्पष्ट रहते हैं, वे उत्कृष्ट सं • संवाददाताओं से हो सकता है, और इस तरह अनेक रंगों, मात्रात्मक सं • bioimagin के एक नए युग को खोलने के लिए शक्ति है सिद्ध कर दिया हैउच्च स्थानिक और लौकिक प्रस्तावों के साथ 1 ग्राम, 5। अन्य उपलब्ध फ्लोरोसेंट सं • जांच छोटे रासायनिक यौगिकों, जो कोशिकाओं में लोड करने की जरूरत है, और अचल द्वारा सं • 6 संशोधित कर रहे हैं पर आधारित हैं। सं • संवेदनशील छोटे fluorophores के अतिरिक्त नुकसान से अपनी क्षमता cytotoxicity और अपेक्षाकृत कम विशिष्टता है जो यह मुश्किल के लिए उन्हें एक विश्वसनीय, विश्लेषणात्मक और निर्णायक ढंग से 7, 8, 9 में उपयोग करने के लिए कर रहे हैं। हालांकि आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट जांच के प्रभावी उपयोग के कुशल जीन स्थानांतरण तकनीक की आवश्यकता है, एफपी आधारित आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सेंसर अनिवार्य उपकरण है कि कोशिकाओं को 10, 11 की अंदरूनी कामकाज के बारे में हमारी समझ में क्रांति ला दी है के रूप में उभरा है। , एक एकल एफ एफ पी-आधारित geNOps के विकास से पहलेörster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) आधारित सं • सेंसर, के रूप में NOA-1 12, निर्माण किया गया था भेजा। सातो एट अल। इस अत्याधुनिक जांच है कि (SGC) सं • संवेदनशील घुलनशील guanylate साइक्लेज की दो यूनिटों, दोनों संयुग्मित को झल्लाहट आधारित सेंसर रिपोर्टिंग चक्रीय ग्वानोसिन मोनोफास्फेट (cGMP) के स्तर के होते हैं 12 बनाया गया है। इस जांच cGMP के लिए जवाब है, यह केवल परोक्ष रूप से intracellular सं • उतार चढ़ाव 12 होश। NOA -1 नैनो-दाढ़ श्रेणी में कोई • उन्नयन के लिए जवाब है हालांकि, इस उपकरण शायद उपलब्धता और इस भारी द्विपक्षीय सेंसर की साध्यता के बारे में सीमाओं के कारण अब तक अक्सर इस्तेमाल नहीं किया गया है।
सं •, जो प्रभाव मौलिक जैविक प्रक्रियाओं में अच्छी तरह से 13, 14 विशेषता किया गया है की बहुमुखी कार्य करता है। कई अध्ययनों से साबित कर दिया कि कोई • concentration कोशिकाओं और उप भीतर स्वास्थ्य और रोगों 14, 15, 16 में सेल भाग्य निर्धारित करता है। Mammalians में, सं • मुख्य रूप से enzymatically विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में अच्छी तरह से विशेषता नाइट्रिक ऑक्साइड synthase (ओपन स्कूल) परिवार 17 से उत्पन्न होता है। अब तक, ओपन स्कूल के तीन isoforms 18 में वर्णित किया गया है, 19, 20; इन सीए 2 / calmodulin निर्भर endothelial ओपन स्कूल (एनोस या ओपन स्कूल-3) 18 और neuronal ओपन स्कूल (nNOS या ओपन स्कूल -1) 19, और सीए 2 / calmodulin स्वतंत्र अनिवार्यता से सक्रिय inducible ओपन स्कूल (INOS या NOS- हैं 2) 20। इसके अलावा, mitochondrial ओपन स्कूल (mtNOS) के अस्तित्व को भी 21 सुझाव दिया गया है। हालांकि, mtNOS nNOS की एक splicing प्रकार के रूप में माना जाता है, और इसलिए अलग से वर्गीकृत नहीं है एक isoform 21 के रूप में। एक और isoform, के अलावा स्तनधारी कोशिकाओं में उन लोगों से, तथाकथित बैक्टीरियल ओपन स्कूल (bNOS), मुख्य रूप से ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया 22 में पाया जाता है। सं • के enzymatic उत्पादन अत्यधिक नियंत्रित किया जाता है और इस तरह के निकोटिनामाइड एडेनाइन डाईन्यूक्लियोटाइड फॉस्फेट (NADPH) के रूप में कई सहकारकों की उपलब्धता पर निर्भर करता है, एडेनाइन डाईन्यूक्लियोटाइड (एफएडी), tetrahydrobiopterin (BH4), आणविक ऑक्सीजन और एल arginine 17 पीला रंग। Cationic अमीनो एसिड एल arginine सब्सट्रेट कि कोई • उत्पादन 17 पर एल citrulline में बदल जाती है। सं • के उच्च विनियमित एंजाइमी पीढ़ी के अलावा, यह माने गया है कि कट्टरपंथी कमी वाली स्थिति 23 के तहत कम किया जा सकता माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा नाइट्राइट पूल से गैर enzymatically। एक बार कोई • एक कोशिका के भीतर उत्पादन किया जाता है, यह स्वतंत्र रूप biomembranes 14 के माध्यम से फैलाना कर सकते हैं,रेफरी "> 15। हालांकि, इस कट्टरपंथी के बहुत ही कम आधा जीवन मुख्य रूप से पर्यावरण की स्थिति से निर्धारित होता है, और विभिन्न रास्ते और रासायनिक प्रतिक्रियाओं कुशलता सं • स्तरों 24 नीचा। आखिरकार, गठन, प्रसार, और सं • की गिरावट निर्भर करता है विविध पर्यावरण मानकों पर जो अत्यधिक जैविक रूप से सक्रिय अणु 24 के प्रभावी एकाग्रता का निर्धारण।
GeNOps प्रौद्योगिकी (उप) सेलुलर सं • अस्थिरता 1 की प्रत्यक्ष पता लगाने के लिए अनुमति देता है और इसलिए reinvestigate करने के लिए उपयुक्त है, और नव तंत्र buildup और सेलुलर सं • संकेतों के अपघटन के लिए जिम्मेदार खोजने के लिए। यहाँ, हम सरल, प्रोटोकॉल और geNOps के उपयोग exogenously पैदा की कल्पना करने के लिए प्रतिनिधि परिणाम और endogenously उत्पन्न सं • प्रोफाइल प्रदान व्यक्ति की कोशिकाओं के स्तर पर। इसके अलावा, geNOps प्रौद्योगिकी एपी के लिए अनुकूलित किया जा सकताअन्य सेल मॉडल प्रणाली में तह विविध सेलुलर उत्तेजनाओं और तनाव के लिए प्रतिक्रिया में कोई • गठन, प्रसार, और गिरावट की जटिल पैटर्न का अध्ययन करने के लिए।
जीव विज्ञान के 28 में एक महत्वपूर्ण संकेत अणु के रूप में कोई • की खोज के बाद से, एकल कोशिकाओं, ऊतकों और एक व्यावहारिक और विश्वसनीय ढंग से उच्च संकल्प के साथ पूरी पशुओं में कट्टरपंथी के विशिष्ट वास्तविक समय माप आकांक्षी कर दिया गया है। यहाँ हम हाल ही में विकसित आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट सं • जांच (geNOps) कि सटीक व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 1 का उपयोग कर कोई • संकेतों के लाइव सेल इमेजिंग सक्षम के आवेदन की रिपोर्ट।
व्यापक और आक्रामक अभिकर्मक प्रक्रियाओं HEK सेल क्लोन कि स्थिरतापूर्वक हरी फ्लोरोसेंट जी geNOp व्यक्त exogenously उत्पन्न एकल कोशिका सं • प्रोफाइल यों इस्तेमाल किया गया था नाकाम करने के लिए। जैसा कि HEK कोशिकाओं सामान्य रूप से कोई • endogenously 29 की उपज नहीं है, इस प्रकार की कोशिका एक geNOp आधारित सेंसर सेल लाइन की पीढ़ी है, जो सह-संस्कृति की स्थिति में कई अन्य अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी हो सकता है के लिए उपयुक्त हैकोई साथ • प्राथमिक कोशिकाओं या यहां तक कि जानवरों 30 में रहने वाले का निर्माण किया। हालांकि, इस अध्ययन में हम विभिन्न सं • -liberating यौगिकों की क्षमता, विभिन्न सांद्रता और stabilities की, जी geNOp व्यक्त HEK सेल मॉडल का उपयोग कर intracellular सं • संकेतों पैदा करने के लिए प्रदर्शित करता है। हमारे डेटा से पता चला है कि सं • -donor एकाग्रता, गुणवत्ता और आवेदन की विधि अंततः intracellular सं • प्रोफाइल के पैटर्न का निर्धारण। इस तरह की सूचना अलग नहीं • दाताओं, जो कई रोगों का संकेत कर रहे हैं के बगल में फ़ार्माकोकायनेटिक लक्षण वर्णन के लिए अपरिहार्य है। विशेष रूप से, geNOps स्थिरतापूर्वक एक बहुत लंबे समय 1 से अधिक सं • -donor दालों के कई दोहराए आवेदन करने के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए दिखाया गया है। तदनुसार, उपयोग नहीं कर • इस के साथ साथ प्रस्तुत यौगिकों -liberating प्रयोगों, विभिन्न आयाम और संबंधित सेलुलर सं के कैनेटीक्स के बारे में अर्द्ध मात्रात्मक निष्कर्ष अनुमति देते हैं226; संकेतों (आंकड़े 1 और 2)।
हालांकि स्थिरतापूर्वक व्यक्त HEK सेल क्लोन शायद एक एकल कोशिका से निकलती है, जी geNOps अभिव्यक्ति के स्तर की एक व्यापक विविधता (चित्रा 1) मनाया गया। के रूप में (जीनोम एकीकृत) ब्याज की जीन का प्रतिलेखन जैसे विविध पर्यावरण तनाव 31 कि सेल विकास दर 32 को प्रभावित के रूप में कई कारकों के नियंत्रण में है यह स्थिर सेल क्लोन की एक आम सुविधा है, और सेल चक्र स्थिति 33। एकल एफपी आधारित geNOps गैर ratiometric जांच कर रहे हैं और, इसलिए, कोई • geNOp अभिव्यक्ति के स्तर 1 के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता बढ़ जाती है की हानि प्रेरित। तदनुसार, geNOps संकेतों को सामान्य बनाने में विशेष रूप से एक तुलनात्मक विश्लेषण के मामले में सेलुलर सं • संकेतों बढ़ाता के लिए आवश्यक है। हमारे हाल के एक अध्ययन, एक सख्त रैखिक संबंध ख में दिखाया गया हैetween geNOps के बेसल प्रतिदीप्ति तीव्रता और प्रतिदीप्ति तीव्रता का एक व्यापक रेंज पर कोई • प्रेरित प्रतिदीप्ति शमन की ताकत 1 पाया गया है। इस सेलुलर सं • संकेतों के पूर्ण मात्रा का ठहराव के लिए geNOps की एक महत्वपूर्ण विशेषता है। एनओसी-7 के जवाब में चित्रा 1, जी geNOps संकेतों को सामान्य बनाने में दिखाया गया है और एसएनपी एक ही थाली से सजातीय सं • विभिन्न HEK कोशिकाओं में संकेतों का पता चला, यह दर्शाता है कि HEK कोशिकाओं को अपनी क्षमता को लेने के लिए के संबंध के साथ विविध नहीं हैं और नीचा सं • कट्टरपंथी कि कोई • दाता से निकलती है। इसके विपरीत, हेला कोशिकाओं में geNOps का उपयोग कर एनओसी-7 के जवाब में सेलुलर सं • विभिन्न कोशिकाओं के बीच संकेतों के स्पष्ट विषमताओं का प्रदर्शन किया। इन मतभेदों को सेल प्रकार विशिष्ट सं • चयापचय और अपघटन दरों को इंगित, सेल शरीर विज्ञान और विकृति में कई निहितार्थ हैं हो सकता है, और geNOp का उपयोग कर पर्दाफाश किया जा सकताप्रौद्योगिकी।
फिर भी, geNOps की दो महत्वपूर्ण विशेषताएं सेंसर और डेटा व्याख्याओं के सही उपयोग के लिए ध्यान से विचार किया जाना है: i) geNOps पर्याप्त लोहे की आवश्यकता होती है (द्वितीय) पूरी तरह से नहीं • 1 के लिए प्रतिक्रिया करने और ii) एफपी संस्करण पर निर्भर करता है, geNOps कर सकते हैं पीएच संवेदनशील 1 हो। यहाँ हम एक प्रोटोकॉल है कि geNOps, जो या तो HEK, हेला या EA.hy926 कोशिकाओं (प्रोटोकॉल 2.6 देखें) में व्यक्त कर रहे हैं की nontoxic आयरन (II) पूरकता के लिए उपयुक्त होने के लिए पाया गया है का वर्णन है। हालांकि यह दिखा दिया है कि लोहे के साथ सेल उपचार (द्वितीय) / विटामिन सी सेल आकृति विज्ञान, सेल व्यवहार्यता और कोशिकाओं 1 की चयापचय क्रिया को प्रभावित नहीं किया है, यह अन्य प्रकार की कोशिकाओं और ऊतकों के लिए यह महत्वपूर्ण कदम अनुकूलन करने के लिए आवश्यक हो सकता है। हालांकि, कुछ प्रयोगात्मक परिस्थितियों में, लोहा (द्वितीय) लोडिंग की आवश्यकता geNOps की प्रयोज्यता की सीमा हो सकती है। विशेष रूप से, यह दिखाया गया है कि एस्कॉर्बेट एन कम कर सकते हैंहे • 35 और एस्कॉर्बेट लोहा (द्वितीय) परिसरों • 36 सं मांजना, 37 में सक्षम हैं। इसके अलावा, अतिरिक्त लौह (द्वितीय) और एस्कॉर्बेट भड़काऊ प्रतिक्रियाओं 39 और uncouple एनोस 41 पैदा कर सकते हैं। इस तरह के प्रभाव जब geNOps प्रौद्योगिकी का उपयोग कर विचार किया जाना चाहिए। यह दिखाया गया है कि कुछ प्रयोगात्मक शर्तों के तहत, intracellular पीएच काफी 34 प्रभावित होता है, जो संभावित geNOps प्रतिदीप्ति 1 को प्रभावित करने की है। विशेष रूप से, सियान और हरे रंग geNOps वेरिएंट अपेक्षाकृत पीएच संवेदनशील अम्लीकरण 1 पर प्रतिदीप्ति की कमी दिखा रहे हैं। इसलिए, (उप) सेलुलर पीएच की तीव्र परिवर्तन झूठी सं • संकेतों जब पीएच संवेदनशील geNOps का उपयोग कर अनुकरण सकता है। हमारे पिछले काम नहीं, कोई • असंवेदनशील geNOps के समानांतर उपयोग (geNOps mut) नकारात्मक विवाद के रूप में सुझाव के रूप मेंरास काटना करने के लिए वास्तविक सेलुलर सं • संकेत पीएच परिवर्तन 1 से सिफारिश की है। इसके अलावा सेलुलर पीएच परिवर्तन जैसे SypHer 34 के रूप में पीएच जांच का उपयोग कर निरीक्षण किया जा सकता है।
इसके अलावा, हम endothelial सेल किराए की EA.hy926 में एक शारीरिक सीए 2 -mobilizing एगोनिस्ट के जवाब में अंतर्जात enzymatic सं • गठन कल्पना। EA.hy926 सेल लाइन एक बार उपयोग किया मॉडल प्रणाली लगातार व्यक्त एनोस 38 है। GeNOps क्षणिक EA.hy926 कोशिकाओं में व्यक्त का प्रयोग करें, इस बात की पुष्टि आईपी 3 मध्यस्थता कि सीए 2 संकेतों आह्वान गहरा सं • इस सेल प्रकार है, जो लगभग पूरी तरह से एल NNA द्वारा अवरुद्ध किया गया था में गठन। आदेश में अस्थायी 2+ सहसंबंधी सीए सं • संकेतों के साथ में, जी geNOp व्यक्त कोशिकाओं यूवी उत्तेजनीय रासायनिक सीए 2 -indicator Fura-2 / AM साथ भरी हुई थी। सीए के वर्णक्रमीय जुदाई 2 + बाध्य और अबाध Fura-2 Fluo जी geNOp संकेत से rescence आसानी से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फिल्टर सेट 40 के साथ प्राप्त किया जा सकता है। इमेजिंग दोनों जांच का अनावरण किया कि सीए 2 -triggered एंजाइमी सं • गठन इस प्रकार endothelial सेल में साइटोसोलिक सीए 2 वृद्धि की तुलना में बहुत धीमी होती है। आईपी 3 -generating एगोनिस्ट ब्रैडीकाइनिन के साथ सेल उपचार पर एकल कोशिका सं • गोजातीय फेफड़े के धमनी से endothelial कोशिकाओं में संकेतों के इसी तरह के कैनेटीक्स, साथ ही कतरनी तनाव का उपयोग कर सूचना दी गई है NOA -1, एक अप्रत्यक्ष अत्यधिक सं • प्रति संवेदनशील सेंसर 12 । तदनुसार, इन आंकड़ों पर जोर सीए 2 -evoked कि एनोस व्युत्पन्न सं • गठन के लिए एक निश्चित मूल्य उस समय तक पूर्ण enzymatic गतिविधि पर पहुंच गया है की आवश्यकता है। सेलुलर सं • गठन, प्रसार और गिरावट के कैनेटीक्स अन्य डेटा से निकाला जा सकता है, जैसे कोई • के तनाव आधारित माप पोत छूट प्रेरितएस एस = "xref"> 26, फ्लोरोसेंट सं • जांच के महान लाभ यह है कि वे सीधे वास्तविक समय में दिखाई संकेतों में सेलुलर सं • उतार चढ़ाव परिवर्तित। इसलिए, इमेजिंग geNOps के साथ सेलुलर सं • संकेतों उच्च स्थानिक और अस्थायी समाधान प्रदान करता है, और (आरई) में अद्वितीय संभावनाएं प्रदान की जांच (उप) सेलुलर सं • homeostasis। उदाहरण के लिए, इमेजिंग एनोस एकल endothelial कोशिकाओं में geNOps तकनीक के साथ संयोजन में 42 चक्कर subcellular स्थानीयकरण और एंजाइम या ऐसे calmodulin और caveolin 43 के रूप में अन्य प्रासंगिक प्रोटीन उत्पादक की सं • translocation के साथ कोई • गठन सहसंबंधी करने के लिए उपयुक्त हो सकता है।
यहाँ हम HEK और EA.hy926 कोशिकाओं को एक पारंपरिक व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति मीटर पर एकल कोशिका स्तर पर और वास्तविक समय में exogenously कल्पना और endogenously उत्पन्न सेलुलर सं • संकेतों को व्यक्त जी geNOp का साध्य आवेदन का वर्णनicroscope। हमारे डेटा मतलब है कि geNOps विशेष ट्रैक करने के लिए (उप) दिलचस्प प्रकार की कोशिकाओं के सभी प्रकार का उपयोग कर विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों के तहत सेलुलर सं • गतिशीलता उपयुक्त हैं।
The authors have nothing to disclose.
The authors acknowledge C.J. Edgell, Pathology Department, University of North Carolina at Chapel Hill, NC, USA for providing the EA.hy926 cells. Author E.E. is supported by Nikon Austria within the Nikon-Center of Excellence, Graz and is a fellow of the Ph.D. program in Molecular Medicine at the Medical University of Graz. The researchers are also supported by the Ph.D. program Metabolic and Cardiovascular Disease (DK-W1226) of the Medical University of Graz. This work was also funded by the FWF project P 28529-B27. Microscopic equipment is part of the Nikon-Center of Excellence, Graz that is supported by the Austrian infrastructure program 2013/2014, Nikon Austria Inc., and BioTechMed, Graz.
NaCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.20 | sodium chloride |
KCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6781.1 | potassium chloride |
CaCl2 .2H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | T885.1 | calcium chloride dihydrate |
MgCl2 .6H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2189.2 | magnesium chloride hexahydrate |
HEPES | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 9105.3 | 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
NaHCO3 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8551.1 | sodium hydrogencarbonate |
KH2PO4 | Merck, Darmstadt, Germany | 104873 | potassium dihydrogen phosphate |
Na2HPO4 .2H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4984.1 | sodium hydrogenphosphate dihydrate |
D(+)-Glucose monohydrate | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6780.1 | >99.5%; for cell culture, endotoxin free; |
EGTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3054.2 | ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid; calcium chelating agent |
NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6771.1 | sodium hydroxide |
HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4625.1 | hydrochloric acid, fuming, 37% (~10 N) |
DMSO | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4720.1 | dimethyl sulfoxide; highly polar, aprotic organic solvent |
L-Glutamic acid hydrochloride | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | G2128 | (S)-2-Aminoglutaric acid |
DMEM, low glucose | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | D5523 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose; with 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
MEM Vitamin solution (100X) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11120037 | 100x the vitamins found in the standard Minimum Essential Medium (MEM) |
MEM Amino acids solution (50X) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11130036 | 50X the essential amino acids (except L-glutamine) found in the standard Minimum Essential Medium (MEM) |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15140122.00 | antibiotics to prevent bacterial contamination of cell cultures |
Amphotericin B | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15290026.00 | Gibco Amphotericin B contains 250 µg of amphotericin B (Fungizone) and 205 µg of sodium deoxycholate; prevents the contamination of cell cultures by yeast and multicellular fungi |
FCS | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270106 | Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin |
PBS, pH 7.4 | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10010031.00 | phosphate-buffered saline |
Fura-2 (AM) | Teflabs, Austin, TX, USA | 102 | fluorescent cytosolic calcium indicators |
Histamine dihydrochlorid | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | H7250 | 2-(4-Imidazolyl)ethylamine dihydrochloride; IP3-generating agonist |
Nω-Nitro-L-arginine | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | N5501 | N5-(Nitroamidino)-L-2,5-diaminopentanoic acid; L-NNA; inhibitor of nitric oxide synthase |
NOC-7 | Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany | 487952 | 3-(2-Hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine; nitric oxide (NO) donor short half-life of NO release |
Sodium nitroprusside dihydrate | Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA | sc-203395A | sodium nitroferricyanide(III) dihydrate; nitric oxide releasing compound |
30-mm Cover slips | Karl Hecht, Sondheim v. d. Rhön, Germany | 41001130 | glass cover slips, HECHT "Assistent", size 1, round, 30-mm, (VE: 100 pcs.) |
Iron(II) booster solution | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | Iron(II) containing physiological buffer for non toxic iron(II) loading of cells; http://www.ngfi.eu/product/ironii-booster-solution/ |
G-geNOp plasmid | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | plasmid DNA encoding green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product/g-genop/ |
G-geNOp AAV5 | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | adenovirus encoding green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product-category/genops/viral-genops-vectors/g-genop-aav5/ |
G-geNOp sensor cell line | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | human embryonic kidney cell line (HEK293) stably expressing green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product-category/genops/g-genop-sensor-cell-line/ |
HEK293A cell line | Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R70507 | subclone of human embryonic kidney cell line (HEK293) |
EA.hy926 cell line | American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, Germany | CRL-2922 | somatic cell hybrid clone of human umbilical vein cell line with a thioguanine-resistant clone of A549 |
TILL iMIC | Till Photonics, Graefling, Germany | n.a. | digital microscope |
Polychrome V monochromator | Till Photonics, Graefling, Germany | n.a. | ultra fast switching |
AVT Stingray F145B | Allied Vision Technologies, Stadtroda, Germany | n.a. | Versatile CCD camera with Sony ICX285 EXview HAD sensor, IEEE 1394b |
alpha Plan Fluar 40 | Zeiss, Göttingen, Germany | n.a. | x40 objective |
dichroic filters | Chroma Technology Corp, Rockingham, Vermont, USA | n.a. | GFP emitter 514/3 nm (515dcxr) |
ValveBank8 Controller | AutoMate Scientific, Inc., Berkeley, California, USA | 01-08 | programmable perfusion system control unit |
BVC control | Vacuubrand, Wertheim, Germany | 727200 | Chemistry diaphragm pump ME 1C; vacuum pump for perfusion system |
ImageJ software | NIH Image | Java image processing program inspired by NIH Image. http://imagej.net/Welcome |