फ्लोरोसेंट जांच के उपयोग के संवर्धित न्यूरॉन्स में एंडोसोम और लियोसोम की क्षमताओं का मात्रा
Summary
तंत्रिका संबंधी कार्यों को समझने के लिए झिल्ली तस्करी की जांच महत्वपूर्ण है। यहां, हम न्यूरॉन्स में फंक्शनल गतिशीलता को मापने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। यह एक सुविधाजनक तरीका है जो तंत्रिका तंत्र में झिल्ली तस्करी की मात्रा का ठहराव करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Abstract
मस्तिष्क में, झिल्ली तस्करी प्रणाली न्यूरॉनल फ़ॉर्म्स, जैसे न्यूरोनल आकृति विज्ञान, सिनाप्टिक प्लास्टिसिटी, अस्तित्व, और ग्लिअल कम्युनिकेशंस को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। आज तक, कई अध्ययनों से पता चला है कि इन प्रणालियों में दोष विभिन्न न्यूरोनल रोगों के कारण होते हैं। इस प्रकार, पुटिका गतिशीलता के नीचे स्थित तंत्र को समझना प्रभावशाली सुराग प्रदान कर सकते हैं जो कई न्यूरोनल विकारों के उपचार में सहायता कर सकते हैं। इमेजज प्लेटफॉर्म के लिए एक सॉफ्टवेयर प्लग-इन का उपयोग करते हुए, हम फुफ्फुसा की गतियों को गति देने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं, जैसे गतिशीलता दूरी और आंदोलन की दर। मात्रा का ठहराव के लिए छवियों को प्राप्त करने के लिए, हमने ईजीएफपी-टैग फॉस्सेल मार्कर प्रोटीन के साथ न्यूरॉनल एन्डोसोम-लियोसोम संरचनाओं को लेबल किया और एक समय चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए vesicles के आंदोलन को देखा। यह विधि बेहद उपयोगी है और न्यूरिटियों में फंक्शनी गतिशीलता को मापने में आसान है, जैसे कि एक्सॉन्स और डेन्ड्राइट्स, साथ ही दोनों न्यूरॉन्स और ग्लिअल कोशिकाओं के सोम में। Furthermoफिर, यह विधि अन्य सेल लाइनों, जैसे फाइब्रोब्लैस्ट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए लागू की जा सकती है। यह दृष्टिकोण झिल्ली तस्करी की हमारी समझ का एक महत्वपूर्ण उन्नति प्रदान कर सकता है।
Introduction
न्यूरोनल फ़ंक्शन के विनियमन के लिए एंडोसोम- लाइसोसोम तस्करी का सटीक नियंत्रण अनिवार्य है। विशेष रूप से, इन vesicles के गतिशील आंदोलन न्यूरॉनल आकारिकी, विकास, और अस्तित्व के नियमन के अधीन एक महत्वपूर्ण कारक हैं। इस प्रणाली में दोष गंभीर न्यूरॉनल विकार 1 , 2 आणविक तंत्र जो कि न्यूरॉन संबंधी रोगों के लिए पित्ती से जुड़े तस्करी का लिंक जटिल माना जाता है, और कई समूहों ने इस प्रासंगिकता की जांच करने की मांग की है। उदाहरण के लिए, यह बताया गया है कि घबराहट के अंतराल की गतिशीलता काफी नीमैन-पिक सी रोग 3 के साथ जुड़ी हुई है, जो लयसोसोम दोषों के कारण विरासत में मिली न्यूरोड अभिकर्मक विकार है। एक अन्य उदाहरण एक लियोसोमल कै 2 + चैनल, ट्रिपील 1 में एक उत्परिवर्तन है, जो लियोसोमोल गतिशीलता को प्रभावित करता है, जिसके परिणामस्वरूप लियोसोमल स्टोरेज रोग 4 , 5 , </समर्थन> 6 हमारे समूह ने सूचित किया है कि PtdIns (3,5) पी 2 कारोबार की कमी के कारण न्यूरॉन्स में एंडोसोम और लाइसोसम गतिशीलता को दबा दिया गया है, जिससे तनाव की प्रतिक्रिया 7 , 8 के लिए भेद्यता में वृद्धि हुई है। पीटीआईएन (3,5) पी -2 के मेटाबोलिक विनियमन, जो ज्यादातर देर एंडोसोम और लाइसोसोम पर केंद्रित होते हैं, विभिन्न प्रकार के सेलुलर फ़ंक्शंस में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जिसमें पुटिया तस्करी और संलयन-विखंडन प्रक्रियाएं 9 , 10 भी शामिल हैं । बिगड़ा PtdIns (3,5) पी 2 टर्नओवर गंभीर neurodegeneration कारण 11 , 12 , endosome-lysosome गतिशीलता के निर्बाध विनियमन neurodegeneration के रोगजनन को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक हो सकता है। पुटिका गतिशीलता के चलने वाले आणविक तंत्र की एक जांच, इस तरह के सुराग प्रदान कर सकती है जो हमारे अंडे को गहरा कर सकती हैकई न्यूरोनल विकारों की बुद्धिमत्ता
इस पत्र में, हम मैनुअल ट्रैकिंग नामक एक फ्री सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग करके न्यूरॉन्स में फंक्शनल गतिशीलता को मापने के लिए एक महत्वपूर्ण विधि प्रस्तुत करते हैं। इसका उद्देश्य पिंड की गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए एक तेज मात्रा का तरीका विकसित करना था। यह मात्रा का ठहराव समयबद्धता फिल्म के प्रत्येक फ्रेम में एक संदर्भ बिंदु पर क्लिक करने के एक मानक दृष्टिकोण के माध्यम से निर्देशित है। मैनुअल ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर के उपयोग से यह अनुप्रयोग काफी सरल और व्यापक उपयोगिता बना देता है, अन्य अनुप्रयोगों के विपरीत इसके अलावा, यह दृष्टिकोण अन्य कोशिकाओं पर भी लागू होता है, जैसे कि ग्लील कोशिकाएं हालांकि यह विधि आदिम है, यह सेलुलर गतिशीलता और रूपात्मक परिवर्तन सहित विभिन्न विश्लेषणों पर लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, छवियों के अनुक्रम में एक संदर्भ बिंदु को परिभाषित करने के बाद, संदर्भ बिंदुओं की स्थिति और प्रत्येक स्थिति के समय की जानकारी अनुक्रमिक छवियों से प्राप्त की जा सकती है, जो डेटा विश्लेषण और छवि प्रसंस्करण नरमबर्तन। एक साथ ले लिया, यह विधि सरल लेकिन शक्तिशाली है और झिल्ली तस्करी के आधार पर अध्ययन में बेहतर दक्षता के विकास में योगदान देता है, जैसे कि एंडोसोम- लाइसोसोम फ़ंक्शन का परीक्षण करना।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में फंक्शनल गतिशीलता को मापने के लिए प्रक्रिया का परिचय दिया गया है। प्राथमिक न्यूरॉन्स, एंडोसोम और लाइसोसोम में छोटे न्यूरॉन्स (4-6 डीआईवी) में उच्च गतिशीलता दिखती है। यह देखते हुए कि न्य?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस विश्लेषण और डॉ मैथ्यू वुड, टकुमा एहारा, और दोंगसूक किम को पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए विकसित करने में मदद करने के लिए, हम डॉ। रिकार्डो डोल्मेत्स्च (स्टैनफोर्ड यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ़ मेडीसिन के लिए वर्तमान सहयोग: बायोमेडिकल रिसर्च के नोवार्टिस इंस्टीट्यूट्स) का धन्यवाद करते हैं।
Materials
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | |
| Dulbecco's modified eagle medium | Wako | 044-29765 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985070 | Serum free medium |
| Hank's balanced salt solution | Thermo Fisher | 14170112 | |
| Penicilin Streptmycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| B-27 Supplements | Thermo Fisher | 17504044 | |
| 2.5% Trypsine | Thermo Fisher | 15090046 | |
| poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| Nylon cell strainer | Corning | 431750 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668027 | Transfection reagent |
| Polyethyleneimine "Max" | polysciences | 24765 | Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/ml Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity. |
| BIOREVO BZ-9000 | Keyence | NA | |
| Incubation system INUG2-K13 | Tokay Hit | NA | |
| GraphPad Prism version 6.0 | GraphPad Software | NA | |
| Excel version 15 | Microsoft | NA | |
| ImageJ verion 1.47 | NA | NA |
References
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