Живые клетки меченых клеток крови при циркуляции глаз могут предоставить информацию о воспалении и ишемии при диабетической ретинопатии и возрастной макулярной дегенерации. Описан протокол для маркировки клеток крови и изображения меченых клеток в кровообращении сетчатки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Флуоресцентная маркировка красителей эритроцитов и лейкоцитов для изучения динамики потока в циркуляции сетчатки мышей
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Динамика сетчатки и хориоидального кровотока может дать представление о патофизиологии и последствиях различных глазных заболеваний, таких как глаукома, диабетическая ретинопатия, возрастная дегенерация желтого пятна (AMD) и другие воспалительные состояния глаз. Это также может помочь контролировать терапевтические реакции в глазу. Надлежащая маркировка клеток крови, в сочетании с визуализацией живых клеток меченых клеток, позволяет исследовать динамику потока в сетчатке и хориоидальной циркуляции. Здесь мы описываем стандартизированные протоколы 1,5% индоцианинового зеленого (ICG) и 1% флюоресцеиновой метки для мышей эритроцитов мышей и лейкоцитов соответственно. Сканирующая лазерная офтальмоскопия (SLO) применялась для визуализации меченых клеток в ретинальном кровообращении мышей C57BL / 6J (дикого типа). Оба метода продемонстрировали различные флуоресцентно меченные клетки в циркуляции сетчатки мыши. Эти методы маркировки могут иметь более широкое применение при различных заболеваниях глазмоделей.
Введение
Изучение динамики течения клеток крови в сетчатке и хориоидальной циркуляции необходимо для понимания патогенеза потенциально опасных для зрения глазных заболеваний и других глазных воспалительных состояний. Однако обычные методы ангиографии, которые связаны с связыванием флуоресцентных красителей с белками плазмы, не дают никакой информации о динамике эритроцитов или лейкоцитов 1 . Динамика потока сетчатки эритроцитов важна для изучения метаболически эффективной циркуляции в сетчатке и динамики потока лейкоцитов, для понимания миграции клеток, распознавания, адгезии и разрушения в различных воспалительных состояниях. Существует несколько флуо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Протоколы животных, используемые в этом исследовании, были одобрены Комитетом по гигиене и использованию животных SingHealth в Сингапуре и соответствуют рекомендациям Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) для использования животных в офтальмологии и зрения Исследование.
1. Маркировка эритроцитов и лейкоцитов флуоресцентными красителями
- Получение реагентов
- Подготовьте ICG (1,5 мг / мл) путем растворения 3 мг ICG в 1800 мкл стерилизованной дистиллированной воды. Добавить 200 мкл 10-фосфатного буферного раствора (PBS).
- Подготовьте 40% 1x PBS, добавив 4 мл 1x PBS в 6 мл стерилизованной дисти....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Эритроциты, помеченные 1,5% -ной МКГ, визуализировались в ретинальной циркуляции мышей C57BL / 6J (дикого типа). Как 1%, так и 5% гематокрит 1,5% ICG меченых эритроцитов были различимы в кровообращении сетчатки. Однако отдельные меченые клетки были более четко визуализированы с 1% гематокритом с 1,5% мечеными ICG эритроцитами ( фиг. 1 ). В 5% гематокрите, из-за большого количества меченых клеток в сосудах сетчатки, нельзя было отметить отдельную клетку. Неко.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Изучение гемодинамики в сетчатке и хориоидальной циркуляции жизненно важно для понимания патофизиологии многих глазных заболеваний. Динамику кровотока в кровообращении сетчатки можно исследовать с помощью фурье-оптической когерентной томографии (FD-OCT), лазерной спекл-флюографии (LSFG) и оксиметрии сетчатки. Хотя в этих методах используются разные подходы к изучению общего кровотока в циркуляции сетчатки 40 , 41 , 42 ,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать. Никакой финансовый или конфликт интересов.
Благодарности
Исследовательский проект финансировался по гранту New Investigator от Национального совета по медицинским исследованиям (NMRC), Сингапур. Команда хотела бы поблагодарить доктора Агравала в Институте офтальмологии (IoO), Университетского колледжа Лондона (UCL) в рамках Национального исследовательского совета по медицинским исследованиям (NMRC) за период с ноября 2012 года по октябрь 2014 года под руководством профессора Дэвид Шима. Доктор Агравал приобрел концепцию и навыки для маркировки клеток и визуализации в лаборатории доктора Шимы. Команда, таким образом, будет признавать надзор и руководство во время обучения стипендиатам от профессора Дэвида Шимы, профессора К....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Кардиозеленый полиметиновый краситель (Индоцианиновый зеленый) | Sigma Aldrich | 12633-50MG | |
| Флуоресцеин 100 мг/мл | Novartis | U1705A/H-1330292 | |
| 10x Фосфатно-солевой буфер (PBS) Ультра чистый Grade | 1st BASE | BUF-2040-10X1L | |
| Бычий сывороточный альбумин | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Микроварежные пробирки с K2E (K2EDTA) - концентрация ЭДТА - 1,8 мг/мл крови | BD, США | REF 365974 | |
| раствор Histopaque 1077 | Sigma Aldrich | 10771 | |
| Центрифуга 5810 R | Eppendorf | 05-413-401 | |
| Микроцентрифуга пробирки 2 мл | Axygen | MCT-200-C-S | |
| Вихревой смеситель | Insta BioAnalytik pte. ltd | FINE VORTEX | |
| Шейкер инкубатор | Lab Tech | ||
| Ceva Кетамин для инъекций (Кетамина гидрохлорид 100 мг/мл) | Ceva | KETALAB03 | |
| ILIUM XYLAZIL-20 (Ксилазина гидрохлорид 20 мг/мл) | Troy Laboratories PTY. Limited | LI0605 | |
| 1% мидриацил 15 мл (тропикамид 1%) | Alcon Laboratories, Inc. США | NDC 0998-0355-15 | |
| 2,5% Мидфрин 5 мл (Фенилэфрина гидрохлорид 2,5%) | Alcon Laboratories, Inc. США | NDC 0998-0342-05 | |
| Шприц Terumo с иглой 1 куб.см/мл Туберкулин | Terumo (Philippenes) Corporation, Филиппины | SS-01T2613 | |
| Гель Vidisic 10 г Dr | . Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Берлин, Германия | ||
| Спиртовые тампоны | Assure медицинские расходные материалы | 7M-004-L-01 | |
| Конфокальная лазерная сканирующая ангиографическая система (Heidelberg Retina Angiograph 2) | Heidelberg Engineering, GmbH, Гейдельберг, Германия | ||
| Программное обеспечение для модуля просмотра Hiedelberg Spectralis, v4.0 | Heidelberg Engineering, GmbH, Гейдельберг, Германия | ||
| Флуоресцентный микроскоп | ZEISS | Модель: axio imager z1 |
Ссылки
- Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent vesicle system. A new technique for measuring blood flow in the retina. Ophthalmology. 101 (10), 1716-1726 (1994).
- Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent lab....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
