Bir IL-8 Geçici Transgenize Edilmiş Fare Modeli<emIn vivo</em> İnflamatuvar Yanıtların Uzun Vadeli İzlenmesi
Summary
Burada açıklanan yöntem, non-invaziv biyolüminesans görüntüleme (BLI) yoluyla farelerin akciğerlerinde IL-8 promotöre bağlı inflamasyon aktivasyonunun görselleştirilmesine olanak tanır. Aynı hayvan lusiferaz muhabiri yapısının teslim edildiği andan itibaren iki aya kadar birden fazla kez BLI'ye tabi tutulabilir.
Abstract
Hava yolu inflamasyonu genellikle bakteriyel enfeksiyonlarla ilişkilidir ve akciğer hastalığının önemli bir belirleyicisini temsil eder. Çeşitli faktörlerin iltihap önleyici yeteneklerinin in vivo olarak belirlenmesi zor ve bronkoalveoler lavaj ve in situ analiz için akciğerlerin çıkarılması gibi terminal prosedürleri gerektirir ve aynı farede uzunlamasına görselleştirme önlenir. Burada, akciğer iltihabı, heterolog bir IL-8 sığır promoterinin kontrolü altındaki lusiferaz raportör genini eksprese eden geçici olarak transgenize edilmiş farelerde Pseudomonas aeruginosa kültür süpernatantının (SN) intratrakeal instilasyonu yoluyla indüklenir. Akciğerdeki lusiferaz ifadesi, instilasyondan sonra 2,5 ila 48 saatlik bir zaman aralığında in vivo biyolüminesan görüntü (BLI) analizi ile izlenir. Prosedür 2 – 3 ay içinde birden fazla kez tekrar edilebilir, böylece aynı farelerde inflamatuvar yanıtı değerlendirmek mümkün olurHayvanları yok etme ihtiyacı var. Bu yaklaşım akciğerde etkili olan pro ve antiinflamatuvar faktörleri gerçek zamanlı olarak izlemeye ve fonksiyonel ve farmakolojik araştırmalara uygun görünmektedir.
Introduction
Astım, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), kistik fibroz (KF) ve bronşektazi gibi kronik akciğer hastalıkları hava yolu inflamasyonu ile karakterizedir. Hava yolu inflamasyonu ödem, hücresel infiltrasyon, T lenfosit ve mast hücresi aktivasyonu, artmış havayolu salgıları ve aşırı kollajen depozisyonu ile karakterizedir. CF çok sistemli bir hastalıktır ve mortalite ve morbiditenin başlıca nedeni akciğer bakteriyel enfeksiyonudur ve pulmoner alevlenme artar. Akciğer fonksiyonundaki azalma, 1 , 2 , 3 , 4 nispeten daha fakir sonuçlara yol açar.
Solunum yollarının iltihaplanma durumu genellikle, balgam gibi alt ve üst hava yollarından türetilmiş materyalde inflamatuar süreç sırasında işe alınan immünolojik belirteçlerin değerlendirilmesiyle gözlemlenir ve değişken reska bul etmez. Bronkoskopiler de yapılır 5 . Murin modelleri, hava yolu inflamasyonu ile karakterize olan ve etkili tedaviler veya tedaviler henüz tanımlanmamış olan hastalıkların patogenezini ve evrimini araştırmak için değerli araçlardır. Akciğer enfeksiyonu ve enflamasyonunun hayvan modelleri, insan koşullarını taklit eden kimyasalların rolü ( örn., Sigara dumanı maruziyeti, LPS, elastaz, ovalbümin, poli I: C vb. De dahil olmak üzere astım ve konakçı-patojen etkileşimlerini incelemek için kullanılmıştır Yukarıdaki kombinasyonlar gibi) 6 . İnflamasyonla ilgili parametrelerin ölçümü, bakteriyel yük, akciğerlerdeki sitokinler ve toplanan bronkoalveoler lavaj (BAL) sıvı gibi faktörleri ölçmek için invaziv yaklaşımlar gerektirdiğinden, hayvanların feda edilmesini gerektirir. Ayrıca, genellikle histolojik incelemeler gereklidir. Enflamatuar yanıt kinetiği hakkında bilgi edinme imkanı numErous fareler. Bu nedenle, hayvanları feda etmeye gerek duymadan bu tür bilgileri elde etmeye yarayan bir teknik, teknik, etik, ekonomik ve operasyonel üsler için değerlidir.
IL-8 iltihaplanma sürecinde lökositleri iltihaplı dokuya sokmak için gerekli bir oyuncudur. Enflamatuar yol aktivasyonunun çalışması için moleküler okuma yazısıdır. MIP-2 ve KC, farelerde insan IL-8'in işlevsel homologları olabilir. Fareler, insan CXCR2 7,8'in bir homologu olan sadece bir potansiyel IL-8 reseptörünü ifade eder, ancak bir raportör geni tahrik eden bir heterolog IL-8 gen promotörünü modüle edebilmektedirler. Bir sığır IL-8 promotör / lusiferaz raportör yapısının farelerde transaktive edilebileceği gözleminden sonra yakın zamanda bir akciğer iltihabı murin modeli geliştirildi. Bu özellik, canlı yaşamda inflamatuvar cevabı izlemek için biyolüminesans görüntülemenin (BLI) kullanılmasına olanak tanırNimals 9 .
Bu model bakteri exoproducts ( örneğin, LPS veya bakteri suşları tarafından salınan ürünler) veya TNFalpha 10 , 11 tarafından tetiklenen iltihap incelemek için uyarlanmıştır. İlaç keşfi süreci, CF, astım ve KOAH gibi akciğer hastalıklarını tedavi edebilen eski ve yeni anti-inflamatuar moleküllerin geliştirilmesi ve optimizasyonu üzerine odaklanmıştır. Bu yeni kimyasal varlıklar, akıllı klinik deneylerin tasarımını kolaylaştırmak için belirli klinik fenotiplerle bağlantılı olabilen hayvan modellerinde hızlı ve rahat bir şekilde test edilmelidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Önceki bir çalışmada 11 , bIL-8-Luc'a bağlı BLI ve BAL işaretleyicileri arasında bir kontrast gösterildi. Fare suşları 12 içindeki duyarlılığın diferansiyel derecesine dayanırdı. Bu nedenle, bIL-8-Luc modelinin farklı bir fare suşuna uygulanması için, hem BLI hem de daha standart hale getirilmiş inflamatuvar belirteçler açısından inflamatuvar yanıta ilişkin ilk çalışma gereklidir.
Fare transfeksiyonu hafif ak…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, İtalyan Kistik Fibroz Vakfı Projesi FFC # 18/2013, FFC # 29/2015 tarafından ve İtalyan Kistik Fibroz Ligi tarafından Veneto Şube Müdürü Veneta Lotta Contro la Fibrosi Cistica Onlus tarafından desteklendi.
Materials
| FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| IVIS Lumina serie II Pre-clinical In Vivo Imaging System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 750 FAST | Perkin Elmer Inc. | NEV10001EX | Protect from light, store the probe at 4 °C |
| Female inbred BalbC | Harlan Laboratories Italy | Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions | |
| bIL-8-Luc plasmid | Department of Medical Veterinary Science, University of Parma, Italy | Store the plasmid at -20 °C | |
| pGL3basic vector | Promega | E1751 | Store the vector at -20 °C |
| JetPEI DNA transfection reagent | Polyplus transfection | 201B-001G | The DNA and JetPEI mix was formulated with a final N/P ratio of 7 |
| D-luciferin potassium salt 1g | Perkin Elmer Inc. | 122796 | Protect from light, store at -20 °C |
| Living Image software | Caliper Life Sciences, | Experimental Builder | |
| Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Do not inhale |
| Bio-Plex Cytokine Assay Kit | Bio-Rad Laboratories | M60-009RDPD | Store the unopened kit at 4 °C |
| Automated cell counter | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
| Gas anesthesia system XGI-8 | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Syringe without needle 5ml | Terumo | SS*05SE1 | Cut the boards of the piston by a scissors |
| Hamilton 0,10 ml (model 1710) | Gastight | 81022 | |
| Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
| Syringe with needle 1ml | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Use without needle |
| Plastic feeding tubes 18ga x 50mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Cut obliquely the tip |
References
- Barnes, P. J. Therapeutic approaches to asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap syndromes. J Allergy Clin Immunol. 136 (3), 531-545 (2015).
- Cohen-Cymberknoh, M., Kerem, E., Ferkol, T., Elizur, A. Airway inflammation in cystic fibrosis: molecular mechanisms and clinical implications. Thorax. 68 (12), 1157-1162 (2013).
- Dhooghe, B., Noel, S., Huaux, F., Leal, T. Lung inflammation in cystic fibrosis: pathogenesis and novel therapies. Clin Biochem. 47 (7-8), 539-546 (2014).
- Durham, A. L., Caramori, G., Chung, K. F., Adcock, I. M. Targeted anti-inflammatory therapeutics in asthma and chronic obstructive lung disease. Transl Res. 167 (1), 192-203 (2015).
- Sagel, S. D. Noninvasive biomarkers of airway inflammation in cystic fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 9 (6), 516-521 (2003).
- Starkey, M. R., et al. Murine models of infectious exacerbations of airway inflammation. Curr Opin Pharmacol. 13 (3), 337-344 (2013).
- Cacalano, G., et al. Neutrophil and B cell expansion in mice that lack the murine IL-8 receptor homolog. Science. 265 (5172), 682-684 (1994).
- Simonet, W. S., et al. Long-term impaired neutrophil migration in mice overexpressing human interleukin-8. J Clin Invest. 94 (3), 1310-1319 (1994).
- Stellari, F. F., et al. In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct. PLoS One. 7 (6), e39716 (2012).
- Stellari, F., et al. In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin. J Transl Med. 13, 251 (2015).
- Stellari, F., et al. In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice. J Transl Med. 14 (1), 226 (2016).
- De Simone, M., et al. Host genetic background influences the response to the opportunistic Pseudomonas aeruginosa infection altering cell-mediated immunity and bacterial replication. PLoS One. 9 (9), e106873 (2014).
