Атомно-силовая микроскопия Исследования распознавания повреждения ДНК при восстановлении эксцизии нуклеотидов
Summary
Here, the study of different DNA lesion recognition approaches via single molecule AFM imaging is demonstrated with the nucleotide excision repair system as an example. The procedures of DNA and protein sample preparations and experimental as well as analytical details for the AFM experiments are described.
Abstract
AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different molecules and molecular assemblies in a heterogeneous sample. In the particular context of DNA interacting protein systems, different protein complex forms and their corresponding binding positions on target sites containing DNA fragments can thus be distinguished. Here, an application of AFM to the study of DNA lesion recognition in the prokaryotic and eukaryotic nucleotide excision DNA repair (NER) systems is presented. The procedures of DNA and protein sample preparations are described and experimental as well as analytical details of the experiments are provided. The data allow important conclusions on the strategies by which target site verification may be achieved by the NER proteins. Interestingly, they indicate different approaches of lesion recognition and identification for the eukaryotic NER system, depending on the type of lesion. Furthermore, distinct structural properties of the two different helicases involved in prokaryotic and eukaryotic NER result in and explain the different strategies observed for these two systems. Importantly, these experimental and analytical approaches can be applied not only to the study of DNA repair but also very similarly to other DNA interacting protein systems such as those involved in replication or transcription processes.
Introduction
Атомно-силовая микроскопия (АСМ) является мощным методом анализа взаимодействий белок-ДНК 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Это требует только небольшого количества материала образца, чтобы непосредственно визуализировать гетерогенные образцы с разрешением на уровне одной молекулы. Неоднородность может быть результатом различных конформационных или олигомерных состояний белка. В частности, в контексте образцов белковой ДНК белковые комплексы могут отображать различные стехиометрии и / или конформации, индуцированные связыванием ДНК в целом или связываясь с конкретным сайтом-мишенью в ДНК. Гетерогенные образцы также могут содержать два (или более) различных вида белков и различный белковый комплексФормы ( например , состоящие только из одного типа белковых и гетеромерных комплексов) могут по-разному взаимодействовать с ДНК. Обсуждаемые здесь исследования используют AFM-визуализацию в воздухе на статических, высушенных образцах репарационных ДНК-белков, связанных с длинными фрагментами ДНК (~ 900 пар оснований, bp), которые содержат поражение, которое представляет собой мишень этих белков. Высокое молекулярное разрешение AFM позволяет различать различные типы белковых комплексов и определять позиции связывания белков на фрагментах ДНК. Важно отметить, что повреждения вносятся в ДНК-субстраты в четко определенных положениях. Поскольку положение участка поражения в ДНК известно, распределения белков, связанных с ДНК, обеспечивают понимание различительных (распознающих) свойств распознавания поражения (различных) белковых комплексов, например , насколько хорошо они распознают определенный тип поражения (по сравнению К неразрушенной ДНК) 2 , 3 , <supClass = "xref"> 4 , 5 , 6 . Их положения в ДНК также позволяют различать белковые комплексы, специфически связанные с поражениями и комплексами, связанными неспецифически в другом месте ДНК. Отдельная характеристика этих различных сложных типов (комплексы, специфически связанные с повреждением против неспецифических комплексов) может выявить потенциальные конформационные изменения в комплексах, индуцированных при идентификации целевого сайта.
Рекомбинантные белки репарации ДНК – это геликазы, которые ответственны за распознавание поражения в пути восстановления иссекающих нуклеотидов (NER). В бактериях NER достигается белками UvrA, UvrB и UvrC. UvrA отвечает за первичное зондирование поражения в ДНК-сканирующем комплексе UvaA 2 / UvrB 2 . После проверки на повреждение UvrB этот комплекс превращается в мономерный UvrB, связанный на участке повреждения, и этот специфический комплекс может затем набирать pРокариотическая эндонуклеаза NER UvrC. UvrC вырезает короткий (12-13 NT) участок одноцепочечной ДНК (оцДНК), содержащей поражение. Отсутствующее растяжение затем снова заполняется ДНК-полимеразой. Наконец, лигаза ДНК уплотняет вновь синтезированное растение с исходной ДНК 9 , 10 . У эукариот большинство белков каскада NER являются частью большого, мультимерного комплекса транскрипционного фактора II H (TFIIH). После первичного обнаружения поражения через тримерный комплекс CEN2-XPC-HR23B, TFIIH рекрутируется в целевой участок ДНК. Когда XPD внутри комплекса проверяет наличие поражения NER-мишени, эукариотические эндонуклеазы NER XPG и XPF рекрутируются для акциза короткого (24-32 nt) участка оцДНК, содержащего поражение 9,10. Здесь, в частности, изучались геликазы UvrB и XPD из прокариот и эукариотических NER, соответственно. Эти геликазы нуждаются в непарномДНК (пузырь ДНК) наматывается на одну из двух одиночных нитей ДНК и затем транслоцируется вдоль этой цепи, подпитываемой гидролизом АТФ. В дополнение к повреждениям ДНК, пузырь ДНК был, следовательно, введен в субстраты, которые функционируют как место загрузки белков.
Процедура получения специфических субстратов ДНК поражения описана ранее 11 . Для этого требуется кольцевая ДНК-конструкция (плазмида) с двумя близко расположенными рестрикционными сайтами для нимазы. В контексте этого исследования была использована плазмида pUC19N (2729 bp) (создана лабораторией С. Вильсона, NIEHS). Эта плазмида содержит три близко расположенные рестрикционные сайты для нимазы Nt.BstNBI, которые образуют 48-нуклеотидное (nt) растяжение. После инкубации с нимазой участок ссДНК между этими сайтами можно удалить и заменить олигонуклеотидом, содержащим любую целевую особенность. После каждой стадии полное ферментативное расщепление испытывают через агарозный гельэлектрофорез. Никеированная кольцевая ДНК может быть различена из-за ее более низкой электрофоретической подвижности по сравнению с исходной суперспирализованной плазмидой. Промежуток ДНК и замещение удаленной вытяжки специфическим олигонуклеотидом субстрата можно оценить путем переваривания ферментом рестрикции, который вырезает субстрат исключительно в области между никами. Таким образом, линеаризация круговой плазмиды ферментом будет подавлена для разрыхленной ДНК и восстановлена после вставки специфического олигонуклеотида. Наконец, два сайта редукции эндонуклеазами (в идеале одиночные резцы) позволяют получить линейный ДНК-субстрат с желаемой длиной и с определенным сайтом-мишенью в определенном положении, а также пузырь ДНК на расстоянии от очага поражения либо в 5 'Или 3' направлении.
Распознавание поражений геликазными НЕР можно исследовать с помощью визуализации АСМ. Замедленная транслокация ДНК геликаз при tОн участок поражения виден как пик в расположении положения белка на ДНК и указывает на распознавание поражения. Поскольку транслокация ДНК этих геликаз является, кроме того, направленной, с полярностью 5'-к-3 ', зависимость распознавания поражения от положения места загрузки (пузырь ДНК вверх или вниз по течению от повреждения) также указывает, является ли поражение преимущественно распознаваемым На транслоцированной или на противоположной, неперемещенной нити оцДНК 5 , 9 . В следующих разделах будут использованы используемые методы, и основные результаты этих экспериментов будут кратко обсуждаться. Важно отметить, что аналогично примерной работе по восстановлению ДНК, показанной здесь, АФМ-визуализация может быть применена к изучению различных взаимодействующих с ДНК систем, таких как репликация ДНК или транскрипция 8 , 12 , 13 , 14 </SUP>.
Protocol
Representative Results
Discussion
AFM статистический анализ положения связывания белков на длинных фрагментах ДНК, которые содержат специфические сайты-мишени, может показать интересные подробности о конкретных стратегиях, используемых белком для распознавания этих сайтов 2 , 3 , <su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PUC19N, CPD-содержащие олигонуклеотиды и p44 были любезно предоставлены Сэмюэлем Уилсоном, Корбинианом Хейлом и Томасом Карелл, Гудрун Михельс и Кэролайн Кискер соответственно. Эта работа была поддержана грантами Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 и TE-671/4 для ИТ.
Materials
| Molecular Force Probe (MFP) 3D | Asylum Research | N/A | atomic force microscope (AFM) |
| Precision 390 | DELL | N/A | computer |
| ThermoMixer and 1.5 ml block | Eppendorf | 5382000015 | heat block for DNA preparation |
| Rotilabo Block-Heater H 250 & blocks for 0.5 ml tubes | Carl Roth GmbH | Y264.1 & Y267.1 | heat block for protein-DNA incubations |
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1704467 | electrophoresis chamber with gel caster and power supply |
| Power Pac Basic | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1645050 | electrophoresis power supply |
| Centifuge 5415 D with rotor | Eppendorf | 2262120-3 | table centrifuge |
| Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15 | Ultralum | 900-1322-02 | UV irradiation table |
| NanoDrop ND-1000 | VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH | N/A | UV spectrophotometer |
| TKAX-CAD with 0.2 μm capsule filter | Unity Lab Services | N/A | water deionization and filter unit |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Software | |||
| MFP software on Igor Pro | Asylum Research | N/A | AFM software |
| ImageJ (open source Java image processing) | NIH Image | N/A | Image analysis software |
| Excel (Microsoft Office) | Microsoft Corporation | N/A | data analysis software |
| Origin9 / Origin2016 | OriginLab Corporation | N/A | statistical data analysis and graphing software |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Material | |||
| OMCL-AC240TS | Olympus | OMCL-AC240TS | AFM cantilevers |
| grade V-5 muscovite | SPI Supplies | 1805 | mica sheets |
| Amicon Ultra 0.5ml 50k Ultracell | Millipore Ireland Ltd. | UFC505096 | centrifuge filters |
| NucleoSpin Extract II | Macherey-Nagel GmbH | 740 609.250 | Agarose gel extraction kit |
| Rotilabo cellulose paper type 111A | Carl Roth GmbH | AP59.1 | AFM deposition blotting paper |
| Anatop 25 (0.02 μm) | Whatman GmbH | 6809-2102 | syringe filter |
| SSpI, BspQI | New England Biolabs (NEB) | R0132, R0712 | restriction enzymes for DNA substrate preparation |
| XhoI, BglII | R0146, R0144 | restriction enzymes for DNA preparation controls | |
| nicking restriction enzyme Nt.BstNBI | New England Biolabs (NEB) | R0607 | nickase |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs (NEB) | M0202S | Ligase |
| Tris, HEPES | Carl Roth GmbH | 4855, 9105 | buffer chemicals |
| NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate | Carl Roth GmbH | 3957, HN03, HN02, P026 | salt chemicals |
| NaAc | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 32318 | salt chemicals |
| DTT, TCEP, EDTA | 6908, HN95, 8040 | chemicals/reagents | |
| agarose, acetic acid, HCl | Carl Roth GmbH | 2267, 3738, K025 | reagents |
| ATPƔS | Jena Bioscience | NU-406 | nucleotides |
| ATP | Carl Roth GmbH | K054 | nucleotides |
| oligonucleotide #1 in Table 1 | Biomers | custom | complementary DNA oligonucleotide |
| oligonucleotides #2, #3, and #6 in Table 1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | custom | fluorescein containing oligonucleotides |
| oligonucleotides #4 and #5 in Table 1 | private (available from e.g. TriLink or GlenResearch) | CPD containing oligonucleotides | |
| SafeSeal reaction tube 0.5 ml and 1.5 ml | Sarstedt | 72.704 and 72.706 | incubation tubes |
| GeneRuler 1 kb | Thermo Scientific | SM0311 | DNA ladder |
| 6x concentrate gel loading dye purple | New England Biolabs (NEB) | 51406 | DNA loading dye |
| Midori Green | Nippon Genetics Europe GmbH | 999MG28055 | DNA stain |
References
- Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture. J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).
- Wang, H., et al. DNA bending and unbending by MutS govern mismatch recognition and specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14822-14827 (2003).
- Tessmer, I., et al. Mechanism of MutS searching for DNA mismatches and signaling repair. J. Biol. Chem. 283 (52), 36646-36654 (2008).
- Wagner, K., Moolenaar, G., van Noort, J., Goosen, N. Single-molecule analysis reveals two separate DNA-binding domains in the Escherichia coli UvrA dimer. Nucleic Acids Res. 37 (6), 1962-1972 (2009).
- Buechner, C. N., et al. Strand-specific recognition of DNA damages by XPD provides insights into nucleotide excision repair substrate versatility. J Biol. Chem. 289 (6), 3613-3624 (2014).
- Van der Linden, E., Sanchez, H., Kinoshita, E., Kanaar, R., Wyman, C. RAD50 and NBS1 form a stable complex functional in DNA binding and tethering. Nucleic Acids Res. 37 (5), 1580-1588 (2009).
- Fuentes-Perez, M. E., Dillingham, M., Moreno-Herrero, F. AFM volumetric methods for the characterization of proteins and nucleic acids. Methods. 60, 113-121 (2013).
- Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Biochemistry. 51, 1500-1509 (2012).
- Wirth, N., et al. Conservation and Divergence in Nucleotide Excision Repair Lesion Recognition. J. Biol. Chem. 291 (36), 18932-18946 (2016).
- Kuper, J., Kisker, C. Damage recognition in nucleotide excision DNA repair. Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 88-93 (2012).
- Buechner, C. N., Tessmer, I. DNA substrate preparation for atomic force microscopy studies of protein-DNA interactions. J. Mol. Recognit. 26 (12), 605-617 (2013).
- Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Sci. Rep. 5, 9625 (2015).
- Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Crampton, N., Kirkham, J., Thomson, N. H. Single-molecule studies of DNA transcription using atomic force microscopy. Phys. Biol. 9 (2), 021001 (2012).
- Maurer, S., Fritz, J., Muskhelishvili, G., Travers, A. RNA polymerase and an activator form discrete subcomplexes in a transcription initiation complex. EMBO J. 25 (16), 3784-3790 (2006).
- Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, (2012).
- Theis, K., Chen, P. J., Skorvaga, M., Van Houten, B., Kisker, C. Crystal structure of UvrB, a DNA helicase adapted for nucleotide excision repair. EMBO J. 18 (24), 6899-6907 (1999).
- Kuper, J., et al. In TFIIH, XPD helicase is exclusively devoted to DNA repair. PLoS Biol. 12 (9), e1001954 (2014).
- Shlyakhtenko, L. S., et al. Silatrane-based surface chemistry for immobilization of DNA, protein-DNA complexes and other biological materials. Ultramicroscopy. 97, 279-287 (2003).
- Roth, H. M., et al. XPB helicase regulates DNA incision by the Thermoplasma acidophilum endonuclease Bax1. DNA Repair. 11 (3), 286-293 (2012).
- Ratcliff, G. C., Erie, D. A. A Novel Single-Molecule Study to Determine Protein-Protein Association Constants. J. Am. Chem. Soc. 123 (24), 5632-5635 (2001).
- Yang, Y., Sass, L. E., Du, C., Hsieh, P., Erie, D. A. Determination of protein-DNA binding constants and specificities from statistical analyses of single molecules: MutS-DNA interactions. Nucleic Acids Res. 33 (13), 4322-4334 (2005).
- Caron, P. R., Grossman, L. Involvement of a cryptic ATPase activity of UvrB and its proteolysis product, UvrB* in DNA repair. Nucleic Acids Res. 16 (22), 10891-10902 (1988).
- Wang, H., et al. UvrB domain 4, an autoinhibitory gate for regulation of DNA binding and ATPase activity. J. Biol. Chem. 281 (22), 15227-15237 (2006).
- Chammas, O., Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Thomson, N. H. Single-stranded DNA loops as fiducial markers for exploring DNA-protein interactions in single molecule imaging. Methods. 60 (2), 122-130 (2013).
- Truglio, J. J., et al. Structural basis for DNA recognition and processing by UvrB. Nat. Struct. Mol. Biol. 13 (4), 360-364 (2006).
- Kuper, J., Wolski, S. C., Michels, G., Kisker, C. Functional and structural studies of the nucleotide excision repair helicase XPD suggest a polarity for DNA translocation. EMBO J. 31 (2), 494-502 (2012).
- Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Goosen, N. The presence of two UvrB subunits in the UvrAB complex ensures damage detection in both DNA strands. EMBO J. 21 (15), 4196-4205 (2002).
- Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Hoeijmakers, J. H., Goosen, N. Architecture of nucleotide excision repair complexes: DNA is wrapped by UvrB before and after damage recognition. EMBO J. 20 (3), 601-611 (2001).
- Moolenaar, G. F., et al. The Role of ATP Binding and Hydrolysis by UvrB during Nucleotide Excision Repair. J. Biol. Chem. 275, 8044-8050 (2000).
