الكفاءة التمثيل الغذائي في المختبر الأنظمة هو شرط أساسي لأحيائي والتصرف فيها المخدرات والمواد السامة. في هذا البروتوكول، وصفنا تطبيق تحقيقات إشارة التمثيل الغذائي لتقييم المرحلة الأولى التمثيل الغذائي في مزارع الخلايا.
أنزيمات استقلاب أجنبي بيولوجيا تلعب وظيفة أساسية في التحول الأحيائي من الأدوية والمواد السامة بإضافة المجموعات الوظيفية التي تزيد من الذوبان وتسهيل إفراز. في بعض الأحيان تلك التعديلات الهيكلية تؤدي إلى تشكيل المنتجات السامة الجديدة. من أجل الحد من التجارب على الحيوانات، المخاطر الكيميائية يمكن تقييم استخدام الخلايا المختصة عملية الأيض. التعبير عن الأنزيمات الأيضية، ولكن، ليست مستقرة على مر الزمن في العديد من أنظمة ثقافة الأولية في المختبر وغالبا ما يكون جزئيا أو غائبة في خطوط الخلايا. ولذلك، ينبغي من الناحية المثالية أن تجرى دراسة الأدوية والمواد المضافة، والبيئية الأيض الملوثات في المختبر في النظم الخلية حيث اتسم النشاط الأيضي. نشرح هنا نهجا لقياس نشاط فئة من الإنزيمات الأيضية (المرحلة الإنسان I) في خطوط الخلايا 2D و 3D الثقافات الأولية باستخدام المجسات الكيميائية ومنتجاتها الأيضية القابلة للقياس من قبل UPLC قياس الطيف الكتلي وluminometry. ويمكن تنفيذ هذه الطريقة لاختبار النشاط الأيضي في خطوط الخلايا والخلايا الأولية المستمدة من مجموعة متنوعة من الأنسجة.
الأيض أجنبي بيولوجيا هو عملية يتم من خلالها تعديل المواد الكيميائية الأجنبية إلى الجسم عن طريق إضافة مجموعة ماء وتقارن لتسهيل إفراز من 1. عادة عملية التمثيل الغذائي للالاكسيوبيوتك هو عملية من خطوتين مع المرحلة الأولى التي تتكون في الغالب من الأكسدة مع إضافة واحدة أو عدة مجموعات الهيدروكسيل 1 و 2. في المرحلة الثانية، يتم استخدام مجموعة الهيدروكسيل كما يقبلون لالمترافقة ماء مثل غلوكورونيد أو شاردة كبريتات 1 و 2. إذا كانت المجموعة متقبل هي بالفعل موجودة على الجزيئات، يمكن أن الخطوة الاقتران يحدث بشكل مستقل عن المرحلة الأولى الأيض. يتم تنفيذ كل رد فعل من قبل مجموعة محددة من الانزيمات، على سبيل المثال، CYPs (السيتوكروم P450s)، التي تحفز على الهيدروكسيل (الشكل 1) ونزع الألكلة من ركائز الكيميائية 3. Conjugatioن ويحفزه sulfotransferases، UDP-glucuronosyltransferases (الشكل 1)، الجلوتاثيون-S-ترانسفيراز وN-acetyltransferases 4. وسيكون لكل الأنسجة والأعضاء لديهم الأيض تعريف معين التعبير الانزيم، مع الكبد معربا عن معظم هذه البروتينات.
الشكل 1: مثال من المرحلة الأولى والمرحلة الثانية الأيض لالكومارين. CYP2A6 / CYP2A13 تحفيز-الهيدروكسيل 7 من الكومارين. ومترافق 7 hydroxycoumarin إلى شاردة غلوكورونيد من المرحلة الثانية الانزيمات UGTs، مع UGT1A6 وUGT1A9 تظهر أعلى نشاط.
فهم عملية التمثيل الغذائي للالاكسيوبيوتك أمر بالغ الأهمية في تقييم مأمونية الأدوية ولتقييم المخاطر الكيميائية وذلك لسببين: سوف حركية التفاعل تحديد متى دواء أو مادة كيميائية سوف تبقى في الجسم في شكل نشطة أو غير نشطة بإفراز efore. والمركب الأصلي يمكن تعديل إلى أنواع أكثر على رد الفعل، غير مستقر والسامة بواسطة أنزيمات التمثيل الغذائي. ردود الفعل هذه التي تعرف أيضا باسم "التنشيط الحيوي" هي التي تحرك معظمهم من المرحلة الأولى CYP الأنزيمات ولكن أيضا في مناسبات نادرة من المرحلة الثانية الاقتران 5.
وبناء على هذا، فإن قدرة نموذجا في المختبر على التنبؤ بدقة المخاطر المرتبطة دواء أو مادة كيميائية تعتمد بشكل كبير على كفاءة التمثيل الغذائي للنظام الخلية. خطوط الخلايا المشتقة من الأنسجة المريضة أو من تحول الخلايا الطبيعية كثيرا ما تفقد جزءا إن لم يكن كل من الأيض الشخصي انزيم ممثل أنسجتهم من أصل 6. الحفاظ على البيانات الشخصية انزيم الأيض الطبيعي يبدو أفضل في مزارع الخلايا الأولية (على الأقل في المدى القصير الثقافات) وتحسنت مرة أخرى إذا كانت الأنسجة مثقف في مصفوفة والسماح لها بالاحتفاظ هيكل 3D في 1. ولذلك، فإن شارacterization من كفاءة التمثيل الغذائي في المختبر نظام خلية خطوة أولية هامة في توجيه القرار بشأن أي نموذج الخلية المناسب لإجراء تقييمات للسلامة الكيميائية.
في هذه الورقة نقدم بروتوكول لمحة عن النشاط والتعبير عن الانزيمات المرحلة الأولى CYP في المختبر مع أمثلة من تطبيقها مع خط الخلية الكبدية 7 و 3D الرئة الأولية الثقافات خلية 8. موصوفة CYP ركائز محددة ومنتجاتها الأيضية والمانع الضوابط جنبا إلى جنب مع spectrometry- كتلة وأساليب القياس الكمي يستند luminogenic. منذ بعض CYPs هي محرض والبعض الآخر التأسيسي، كما سيتم إعطاء أمثلة لهذه السيناريوهات اثنين.
حاليا، العديد من أنظمة اختبار السمية موحدة تستخدم بكتيريا مهندسة، خطوط الخلايا أو الخلايا الجنينية التي ليست ممثلة التمثيل الغذائي الإنسان العادي 1. هذا يمكن أن يؤدي إلى توقعات غير دقيقة من النشاط السامة المحتملة لمادة كيميائية أو دواء. مبتكرة نماذج في المختبر، مثل مزارع الخلايا 3D والجهاز على شريحة، يجري تطويرها في محاولة لتكرار أفضل التشكل الطبيعي والنشاط الأيضي للأنسجة البشرية 21 و 22 و 23. الكفاءة الأيضية هي معيار واحد التي يمكن استخدامها على فك التي هي الأنسب نماذج لدراسات تقييم والتحول الأحيائي المخدرات السمية.
تم تصميم بروتوكول ذكرناها في هذه الورقة لقياس نشاط الانزيمات CYP باستخدام الخلايا الحية. أنها مرنة، ويمكن استخدامها لأنظمة مختلفة من الخلايا في 2D أو 3D الثقافيهوفاق ويوفر خيار لاستخدام إما probe- luminogenic أو النهج القائم على قياس الطيف الكتلي. كلتا الطريقتين حساسة بما يكفي للكشف عن كميات نانوغرام من المواد وتتطلب سوى عدد قليل من الخلايا المزروعة في شكل multiwell. كما يمكن تطبيقها على كروي أو خلايا نمت في مصفوفات معقدة. اختيار الركيزة التحقيق ومن الواضح أن عنصرا حاسما في البروتوكول. خصوصية الفحص تعتمد على التحقيق يجري انتقائية للانزيم CYP وطبقة أخرى من الضمان يمكن الحصول عليها عن طريق استخدام مثبط CYP انتقائي. ركائز ومثبطات المدرجة في هذه الورقة هي مجرد أمثلة قليلة، ولكن الآخرين يمكن العثور عليها في الأدب.
من المهم أن تنظر في حضانة مرات متعددة عند العمل مع نوع من الخلايا الجديدة كما CYP نتيجة النشاط السلبية يمكن أن يكون راجعا إلى إنزيم يجري التعبير عنه عند مستوى منخفض. بالإضافة إلى وجود نوع من الخلايا التي يمكن استخدامها كعنصر تحكم إيجابية مستحسنة لضمان أنلا يرتبط نتائج سلبية لقضية فنية وللمساعدة في أي حل المشاكل. خلايا الكبد الأساسية هي المختصة عملية الأيض، ويمكن استخدامها لمكافحة، على سبيل المثال خلايا الكبد الأولية في تعليق من السهل جدا للاستخدام ولكن قدرتها على الاستمرار محدودة في الوقت المناسب. خطوط الخلايا الكبدية هي البدائل الممكنة التي من السهل نسبيا للاستخدام كما هو موضح في هذا البروتوكول، ولكن بعضها أفضل من غيرها من حيث النشاط الأيضي 6، 21.
منذ الاختبار هو غير مدمرة، ما لم يكن كميا البروتين الكلي، فمن الممكن لمتابعة النشاط CYP مع مرور الوقت في الدراسات الطولية 20. وهذه نقطة مهمة لأن بعض الخلايا سيكون النشاط CYP متغير مع مرور الوقت في الثقافة. قد تكون مرتبطة النتيجة السلبية مع عدم وجود confluency، تقدم مع تمايز أو فقد التمايز في المختبر. في هذه الحالة، فإن هذا النهج هو شبه quantitati-لقد لأنه لا تطبيع البيانات عن طريق المبلغ الإجمالي من البروتين في كل ثقافة الخلية. وليس من الممكن دائما أو الموصى بها لإعادة النسيج بعد قياس النشاط CYP عن التعرض للتحقيقات، مثبطات أو محرضات يمكن أن يكون لها تأثير سام على الأنسجة كما هو الحال بالنسبة لTCDD.
ويمكن أيضا أن أجزاء الخلية مثل microsomes ل أن تستخدم لوصف النشاط CYP من نوع خلية معينة. صغرور الاستعدادات، ومع ذلك، تتطلب الكثير من المواد الخلية، إضافة العوامل المساعدة الكافية والعازلة للتأكد من أن الإنزيمات تبقى نشطة. استخدام الخلايا الحية يلغي خطوة إعداد صغرور صعبة والعمل بها والتي مخازن والعوامل المساعدة بشكل أفضل.
كما توصية عامة، بل هو أفضل الممارسات لزيادة تميز الشخصية تعبير عن CYPs في مزارع الخلايا للتحقق من أن يطابق النشاط الأنزيمي. وأوصى نظرا لهذا مستوى إضافي من التحقق من أن تحقيقات التمثيل الغذائي لا انتيتعتمد محددة لCYP واحد، وأنه يعطي زيادة الثقة في أن النشاط الأيضي قياس يقابله التعبير انزيم المقابلة. منذ CYPs هي بروتينات غشاء أنها صعبة نسبيا للتحضير لالبقع الغربية، وبالتالي الكمي RT-PCR كان النهج المفضل لمحة هذه الانزيمات 20.
ومن المهم أن نلاحظ أن هذا البروتوكول يصف طريقة لنشاط انزيم فحص CYP أن يمثل سوى عائلة واحدة من الإنزيمات الأيضية، وإن كانت هامة. مرونة نهج قياس الطيف الكتلي تسمح للتطوير أساليب اكتساب لالتحولات الأيضية الأخرى من ركائز التحقيق. ومع ذلك، فقد لتطوير تلك في وقت واحد، وهناك عدد أقل حاليا تحقيقات محددة معروفة ومثبطات انتقائية للأسر انزيم الأيضية الأخرى. وينبغي معالجة هذه الفجوة لإتاحة إجراء تقييم شامل لكفاءة التمثيل الغذائي في المختبر خلية التنفسيالآنسة.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Epithelix Sarl and Biopredic International for providing the airway cells and hepatic cells micrographies and Neil Smith for the figure illustrating the experimental procedure.
Reagent & Cells | |||
2 μm syringe filter | Whatman | UN203NPEORG | |
24 well plate | Corning | 3524 | |
4-methylumbelliferone | Sigma Aldrich | M1381 | |
5-phenyl pentyne | Sigma Aldrich | CD5001437 | |
6-hydroxybupropion | Sigma Aldrich | H3167 | |
6-hydroxychlorzoxazone | Sigma Aldrich | UC148 | |
7-ethoxycoumarin | Sigma Aldrich | 195642 | |
7-hydroxycoumarin | Sigma Aldrich | H24003 | |
8-methoxypsoralen | Sigma Aldrich | M3501 | |
acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
acetonitrile | Fisher | A/0626/17 | |
α-naphthoflavone | Sigma Aldrich | N5757 | |
BCA kit | Thermo Scientific | 23227 | |
b-glucuronidase/arylsulfatase | Sigma Aldrich | G0876 | |
Bupropion | Sigma Aldrich | B102 | |
Carbamazepine | Sigma Aldrich | C4024 | |
chlorzoxasone | Sigma Aldrich | C4397 | |
collagen | Cell Systems | 5005-B | |
coumarin | Sigma Aldrich | C4261 | |
disulfiram | Sigma Aldrich | 86720 | |
fluvoxamine | Sigma Aldrich | F2802 | |
Glutamax (Glutamine supplement) | Fisher | 35050061 | |
HepaRG metabolism supplement | Merck | MMAD621 | |
HepaRG thaw media supplement | Merck | MMADD671 | |
HepaRG | Merck | MMHPR116 | |
Luciferin-CEE | Promega | V8751 | |
methanol | Fisher | M/4056/17 | |
MucilAir airway cells | Epithelix | EP01 | |
MucilAir airway cells maintenance media | Epithelix | EP04MM | |
Phenomenex Kinetex 2.6μm, PFP 100A | Phenomenex | 00B-4477-AN | |
TCDD | Sigma Aldrich | 48599 | |
thioTEPA | Sigma Aldrich | T6069 | |
Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8µm 2.1 x 50mm | Waters | 86003538 | |
Williams’ E media | Fisher | 17704-024 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
UPLC | Waters | Acquity | |
QTRAP MS | Sciex | ABI Sciex 4000 | |
QTRAP MS software | Sciex | Analyst 1.4.2 | |
luminometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
cell counter | Beckman Coulter | Vi-Cell XR | |
rotary evaporator | Eppendorf | Eppendorf-5301 |