इन विट्रो प्रणालियों के मेटाबोलिक योग्यता biotransformation और दवाओं तथा विषाक्तता के स्वभाव के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है। इस प्रोटोकॉल में, हम चरण मैं कोशिका संवर्धन में चयापचय का आकलन करने के संदर्भ चयापचय जांच के आवेदन का वर्णन।
जीनोबायोटिक metabolizing एंजाइमों कार्य समूहों कि घुलनशीलता बढ़ाने के लिए और उत्सर्जन की सुविधा जोड़कर दवाओं तथा विषाक्तता के biotransformation में एक महत्वपूर्ण समारोह खेलते हैं। कुछ अवसरों पर उन संरचनात्मक संशोधनों नई विषाक्त उत्पादों के गठन के लिए ले जाते हैं। आदेश पशु परीक्षण कम करने के लिए, रासायनिक जोखिम पाचन सक्षम कोशिकाओं का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता। चयापचय एंजाइमों की अभिव्यक्ति है, तथापि, नहीं समय के साथ स्थिर विट्रो प्राथमिक संस्कृति प्रणालियों में कई में है और अक्सर आंशिक या सेल लाइनों में अनुपस्थित है। इसलिए, दवाओं, योजक, और इन विट्रो में पर्यावरण प्रदूषण चयापचय के अध्ययन आदर्श सेल सिस्टम जहां चयापचय गतिविधि बताया गया है में आयोजित किया जाना चाहिए। हम यहाँ रासायनिक जांच और उनके चयापचय उत्पादों UPLC मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा मात्रात्मक का उपयोग कर 2 डी सेल लाइनों और प्राथमिक 3 डी संस्कृतियों में चयापचय एंजाइमों के एक वर्ग की गतिविधि (मानव पहला चरण) को मापने के लिए एक दृष्टिकोण की व्याख्या औरluminometry। विधि सेल लाइनों और ऊतकों की एक किस्म से प्राप्त प्राथमिक कोशिकाओं में चयापचय गतिविधि का परीक्षण करने के लागू किया जा सकता।
जीनोबायोटिक चयापचय प्रक्रिया है जिसके माध्यम से शरीर के लिए विदेशी रसायन हाइड्रोफिलिक समूहों और conjugates के अलावा द्वारा संशोधित कर रहे हैं उनके उत्सर्जन 1 की सुविधा के लिए है। आमतौर पर xenobiotics के चयापचय मैं एक या एक से अधिक हाइड्रॉक्सिल समूहों 1, 2 के अलावा के साथ एक ऑक्सीकरण की ज्यादातर मिलकर चरण के साथ एक दो कदम प्रक्रिया है। द्वितीय चरण में, हाइड्रॉक्सिल समूहों के रूप में ऐसी glucuronide या सल्फेट आधा भाग 1, 2 के रूप में एक हाइड्रोफिलिक संयुग्म के लिए स्वीकार किया जाता है। एक स्वीकर्ता समूह पहले से ही अणुओं पर मौजूद न हो, विकार कदम चरण चयापचय की स्वतंत्र रूप से हो सकता है। प्रत्येक प्रतिक्रिया एंजाइमों के एक विशिष्ट समूह, जैसे, CYPs (साइटोक्रोम P450s), कि hydroxylation को उत्प्रेरित (चित्रा 1) और रासायनिक substrates 3 की dealkylation द्वारा किया जाता है। Conjugation sulfotransferases द्वारा उत्प्रेरित होता है, यूडीपी glucuronosyltransferases (चित्रा 1), ग्लूटेथिओन-S-transferases और एन acetyltransferases 4। प्रत्येक ऊतक और अंग जिगर उन प्रोटीन का सबसे व्यक्त के साथ एक विशिष्ट चयापचय एंजाइम अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल है,।
चित्र 1: प्रथम चरण और Coumarin के लिए द्वितीय चरण चयापचय का उदाहरण। CYP2A6 / कूमेरिन 7-hydroxylation को उत्प्रेरित CYP2A13। 7-hydroxycoumarin द्वितीय चरण एंजाइमों UGTs द्वारा एक glucuronide आधा भाग को संयुग्मित है, UGT1A6 और UGT1A9 उच्चतम गतिविधि दिखा साथ।
xenobiotics के चयापचय को समझना दवा सुरक्षा के मूल्यांकन में और दो कारणों के लिए रासायनिक जोखिम मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण है: प्रतिक्रिया गतिकी का निर्धारण करेगा कब तक एक दवा या रासायनिक एक सक्रिय या निष्क्रिय रूप ख में शरीर में ही रहेगाefore उत्सर्जन; और माता पिता के परिसर चयापचय एंजाइमों से एक है, और अधिक प्रतिक्रियाशील अस्थिर और विषाक्त प्रजातियों के लिए संशोधित किया जा सकता। ऐसी प्रतिक्रियाएं भी रूप में "bioactivation" ज्ञात ज्यादातर चरण मैं एंजाइमों CYP लेकिन यह भी द्वितीय चरण विकार 5 से दुर्लभ अवसरों पर से प्रेरित हैं।
इस के आधार पर, एक इन विट्रो मॉडल की क्षमता सही रूप में एक दवा या एक रासायनिक के साथ जुड़े जोखिम की भविष्यवाणी करने के लिए सेल प्रणाली के चयापचय योग्यता पर बहुत निर्भर है। सेल लाइनों रोगग्रस्त ऊतकों से या सामान्य कोशिकाओं के परिवर्तन से प्राप्त अक्सर हिस्सा मूल 6 के अपने ऊतक के चयापचय एंजाइम प्रोफ़ाइल प्रतिनिधि के सभी नहीं तो खो देते हैं। सामान्य चयापचय एंजाइम प्रोफ़ाइल के रखरखाव के प्राथमिक सेल संस्कृतियों में बेहतर (कम से कम अल्पावधि संस्कृतियों में) प्रकट होता है और अगर ऊतक एक मैट्रिक्स वह अपने 3 डी संरचना 1 बनाए रखने के लिए अनुमति देता है में सुसंस्कृत है आगे सुधार हुआ है। इसलिए, चारएक इन विट्रो सेल प्रणाली के चयापचय योग्यता के acterization के बारे में निर्णय जो सेल मॉडल रासायनिक सुरक्षा मूल्यांकन का संचालन करने के लिए उपयुक्त है मार्गदर्शन में एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक कदम है।
इस पत्र में हम एक यकृत सेल लाइन 7 और 3 डी प्राथमिक फेफड़ों कोशिका संवर्धन 8 के साथ अपने आवेदन के उदाहरण के साथ गतिविधि और इन विट्रो में प्रथम चरण CYP एंजाइमों की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। CYP विशिष्ट substrates, उनके चयापचय उत्पादों और अवरोध करनेवाला नियंत्रण जन spectrometry- और luminogenic आधारित मात्रा तरीकों के साथ साथ वर्णित हैं। के बाद से कुछ CYPs inducible हैं और दूसरों को संघटित कर रहे हैं, उदाहरण भी उन दो स्थितियों के लिए दिया जाएगा।
वर्तमान में, कई मानकीकृत जहर परीक्षण सिस्टम इंजीनियर बैक्टीरिया, सेल लाइनों, या भ्रूण कोशिकाओं कि सामान्य मानव चयापचय 1 के प्रतिनिधि नहीं हैं का उपयोग करें। यह एक रासायनिक या दवा के संभावित विषाक्त गतिविधि का गलत भविष्यवाणियों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। इस तरह 3 डी सेल संस्कृतियों और एक चिप पर अंग के रूप में इन विट्रो मॉडल, में अभिनव, बेहतर सामान्य आकृति विज्ञान और मानव ऊतकों 21, 22, 23 की चयापचय गतिविधि को दोहराने के प्रयास में विकसित किया जा रहा। मेटाबोलिक योग्यता एक कसौटी यह है कि समझने के लिए जो मॉडल सबसे अच्छा जहर मूल्यांकन और दवा biotransformation के अध्ययन के लिए अनुकूल हैं इस्तेमाल किया जा सकता है।
प्रोटोकॉल हम इस पत्र में रेखांकित किया है जीवित कोशिकाओं का उपयोग कर CYP एंजाइमों की गतिविधि को मापने के लिए बनाया गया है। यह लचीला है और 2 डी या 3 डी संस्कृतियों में अलग सेल प्रणाली के लिए इस्तेमाल किया जा सकताes और या तो एक luminogenic probe- या एक मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करें विकल्प प्रदान करता है। दोनों ही तरीकों से काफी संवेदनशील सामग्री की nanogram मात्रा का पता लगाने के लिए और केवल एक multiwell प्रारूप में उगाई जाने वाली कोशिकाओं की एक छोटी संख्या की आवश्यकता है। उन्होंने यह भी उपगोल करने के लिए या लागू किया जा सकता कोशिकाओं जटिल मैट्रिक्स में वृद्धि हुई। जांच सब्सट्रेट के चयन स्पष्ट रूप से प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण तत्व है। परख की विशिष्टता जांच CYP एंजाइम और आश्वासन की एक और परत के चुनिंदा जा रहा है एक चयनात्मक CYP अवरोध करनेवाला के उपयोग के द्वारा प्राप्त किया जा सकता पर निर्भर करता है। substrates और इस पत्र में सूचीबद्ध अवरोधकों सिर्फ कुछ उदाहरण हैं, लेकिन दूसरों के साहित्य में पाया जा सकता है।
यह जब एक नकारात्मक CYP गतिविधि परिणाम के रूप में एक नया सेल प्रकार के साथ काम करने के कारण हो सकता करने के लिए एंजाइम एक निम्न स्तर पर व्यक्त की जा रही कई ऊष्मायन बार विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक सेल प्रकार है कि एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता के अलावा है कि एक सुनिश्चित करने के लिए सलाह दी जाती हैनकारात्मक परिणाम किसी तकनीकी समस्या के और किसी भी समस्या का निवारण करने जुड़ा हुआ नहीं है। प्राथमिक यकृत कोशिकाओं पाचन सक्षम हैं और निलंबन में उदाहरण प्राथमिक हेपाटोसाइट्स के लिए, नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता उपयोग बहुत ही आसान कर रहे हैं लेकिन उनकी व्यवहार्यता समय में सीमित है। यकृत सेल लाइनों संभव विकल्पों जो अपेक्षाकृत रूप में इस प्रोटोकॉल में वर्णित का उपयोग करने के लिए आसान कर रहे हैं, लेकिन कुछ चयापचय गतिविधि 6, 21 के मामले में दूसरों से बेहतर हैं।
के बाद से परख गैर विनाशकारी, जब तक कुल प्रोटीन की मात्रा निर्धारित किया जाता है, यह अनुदैर्ध्य अध्ययन 20 में समय के साथ CYP गतिविधि का पालन करना संभव है। यह एक महत्वपूर्ण बिंदु है क्योंकि कुछ कोशिकाओं संस्कृति में समय के साथ चर CYP गतिविधि होगा। एक नकारात्मक परिणाम भेदभाव या इन विट्रो में dedifferentiation साथ confluency की कमी, प्रगति के साथ जुड़ा हो सकता है। उस मामले में, दृष्टिकोण अर्द्ध quantitati हैve के बाद से डेटा प्रत्येक सेल संस्कृति में प्रोटीन की कुल राशि के आधार पर सामान्यीकृत नहीं है। यह जांच, inhibitors या inducers के लिए जोखिम के रूप में CYP गतिविधि को मापने के ऊतक पर एक जहरीले प्रभाव हो सकता है के रूप में TCDD के लिए मामला है के बाद ऊतक का पुन: उपयोग करने के लिए संभव है या सिफारिश की हमेशा नहीं है।
इस तरह के microsomes के रूप में सेल अंशों भी जब किसी सेल प्रकार के CYP गतिविधि चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। Microsome तैयारी, हालांकि, सेल सामग्री, पर्याप्त सहकारकों के अलावा के एक बहुत आवश्यकता होती है और यह सुनिश्चित करें कि एंजाइमों सक्रिय रहते हैं बफ़र। जीवित कोशिकाओं का उपयोग करना मुश्किल microsome तैयारी चरण निकल और बाहर काम कर रहा है जो बफ़र्स और सहकारकों सबसे अच्छा काम करते हैं।
एक सामान्य सिफारिश के रूप में, यह एक सबसे अच्छा अभ्यास आगे कोशिका संवर्धन में CYPs की अभिव्यक्ति प्रोफाइल चिह्नित करने के लिए है कि यह एंजाइमी गतिविधि से मिलान सत्यापित करने के लिए है। सत्यापन के इस अतिरिक्त स्तर को देखते हुए अनुशंसित है कि चयापचय जांच Enti नहीं कर रहे हैंएक भी CYP के लिए विशिष्ट भरोसा करते हैं और यह बढ़ विश्वास है कि मापा चयापचय गतिविधि इसी एंजाइम अभिव्यक्ति के अनुरूप है देता है। चूंकि CYPs झिल्ली प्रोटीन हैं वे पश्चिमी दाग के लिए तैयार करने के लिए अपेक्षाकृत मुश्किल हो जाता है, इसलिए मात्रात्मक आरटी-पीसीआर पसंदीदा दृष्टिकोण इन एंजाइमों 20 प्रोफ़ाइल किया गया है।
यह नोट करना इस प्रोटोकॉल परख CYP एंजाइम गतिविधि है कि केवल चयापचय एंजाइमों के एक परिवार का प्रतिनिधित्व करता है, एक महत्वपूर्ण यद्यपि के लिए एक विधि का वर्णन करता है कि महत्वपूर्ण है। एक मास स्पेक्ट्रोमेट्री दृष्टिकोण के लचीलेपन जांच substrates के अन्य चयापचय परिवर्तनों के लिए अधिग्रहण विधियों के विकास की अनुमति देता है। हालांकि, उन एक समय में एक से विकसित किया जाना है और वहाँ वर्तमान में कम जाना जाता विशिष्ट जांच और अन्य चयापचय एंजाइम परिवारों के लिए चयनात्मक inhibitors हैं। इस अंतर को इन विट्रो सेल syste के चयापचय योग्यता के लिए एक व्यापक मूल्यांकन के लिए अनुमति देने के लिए संबोधित किया जाना चाहिएसुश्री।
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Epithelix Sarl and Biopredic International for providing the airway cells and hepatic cells micrographies and Neil Smith for the figure illustrating the experimental procedure.
Reagent & Cells | |||
2 μm syringe filter | Whatman | UN203NPEORG | |
24 well plate | Corning | 3524 | |
4-methylumbelliferone | Sigma Aldrich | M1381 | |
5-phenyl pentyne | Sigma Aldrich | CD5001437 | |
6-hydroxybupropion | Sigma Aldrich | H3167 | |
6-hydroxychlorzoxazone | Sigma Aldrich | UC148 | |
7-ethoxycoumarin | Sigma Aldrich | 195642 | |
7-hydroxycoumarin | Sigma Aldrich | H24003 | |
8-methoxypsoralen | Sigma Aldrich | M3501 | |
acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
acetonitrile | Fisher | A/0626/17 | |
α-naphthoflavone | Sigma Aldrich | N5757 | |
BCA kit | Thermo Scientific | 23227 | |
b-glucuronidase/arylsulfatase | Sigma Aldrich | G0876 | |
Bupropion | Sigma Aldrich | B102 | |
Carbamazepine | Sigma Aldrich | C4024 | |
chlorzoxasone | Sigma Aldrich | C4397 | |
collagen | Cell Systems | 5005-B | |
coumarin | Sigma Aldrich | C4261 | |
disulfiram | Sigma Aldrich | 86720 | |
fluvoxamine | Sigma Aldrich | F2802 | |
Glutamax (Glutamine supplement) | Fisher | 35050061 | |
HepaRG metabolism supplement | Merck | MMAD621 | |
HepaRG thaw media supplement | Merck | MMADD671 | |
HepaRG | Merck | MMHPR116 | |
Luciferin-CEE | Promega | V8751 | |
methanol | Fisher | M/4056/17 | |
MucilAir airway cells | Epithelix | EP01 | |
MucilAir airway cells maintenance media | Epithelix | EP04MM | |
Phenomenex Kinetex 2.6μm, PFP 100A | Phenomenex | 00B-4477-AN | |
TCDD | Sigma Aldrich | 48599 | |
thioTEPA | Sigma Aldrich | T6069 | |
Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8µm 2.1 x 50mm | Waters | 86003538 | |
Williams’ E media | Fisher | 17704-024 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
UPLC | Waters | Acquity | |
QTRAP MS | Sciex | ABI Sciex 4000 | |
QTRAP MS software | Sciex | Analyst 1.4.2 | |
luminometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
cell counter | Beckman Coulter | Vi-Cell XR | |
rotary evaporator | Eppendorf | Eppendorf-5301 |