向表达人类α-突触核蛋白A53T家族性突变和萤火虫荧光素酶的Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-)小鼠腹腔或舌部外周注射α-突触核蛋白纤维，可诱导其中枢神经系统产生神经病理学改变，包括神经炎症。
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本文内容
摘要
摘要
为了研究错误折叠α-突触核蛋白的朊病毒样行为，需要能够快速且简便地传播α-突触核蛋白朊病毒样颗粒并引发中枢神经系统（CNS）神经病理学改变的小鼠模型。本文描述了将α-突触核蛋白纤维注射到双转基因Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-)小鼠体内，足以诱导神经病理学疾病，注射途径可为舌内注射或腹腔注射。该小鼠模型在朊病毒蛋白启动子驱动下过表达携带A53T突变的人源α-突触核蛋白，并在胶质纤维酸性蛋白（Gfap）启动子驱动下表达萤火虫荧光素酶。与纯合子Tg(M83+/+)小鼠相比，后者从8个月龄开始出现严重的神经系统症状，而杂合子Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-)小鼠在达到22个月龄前不会自发产生疾病。有趣的是，通过腹腔注射α-突触核蛋白纤维后，五只Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-)小鼠中有四只出现以瘫痪为特征的神经系统疾病，中位潜伏期为229 ± 17天。患病动物的大脑和脊髓中出现大量磷酸化α-突触核蛋白的沉积。这些α-突触核蛋白聚集体不溶于沙克斯尔（sarkosyl），并与泛素和p62共定位，同时伴随炎症反应，导致星形胶质细胞增生和小胶质细胞活化。出乎意料的是，舌内接种α-突触核蛋白纤维在诱导疾病方面效果较差，五只注射小鼠中仅有一只在285天后表现出α-突触核蛋白病理改变。我们的研究结果表明，通过舌内途径接种，尤其是通过腹腔途径接种，能够在Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-)小鼠中成功诱导具有突触核蛋白病典型特征的神经系统疾病。这为深入研究由α-突触核蛋白朊病毒样颗粒引发的朊病毒样发病机制提供了一个新的模型。
引言
越来越多的证据表明，α-突触核蛋白具有与朊病毒蛋白相似的特性，尤其是在其能够自我成核并在细胞之间以及沿神经通路传播错误折叠方面。α-突触核蛋白的特性也被称为“类朊病毒”或“朊样”，这一观点得到了移植实验观察结果的支持，提示错误折叠的α-突触核蛋白可从病变神经元传播至新移植的健康神经元。1,2,3,4此外，将错误折叠的α-synuclein直接注射到脑内或外周组织中， 例如 后肢肌肉或肠壁的病变会导致α-突触核蛋白病理学改变在中枢神经系统远端部位扩散5,6,7,8,9,10我们进一步详细分析了α-突触核蛋白朊病毒样物质通过外周途径的传播，并探讨了一个问题：错误折叠的α-突触核蛋白在单次舌内或腹腔注射后是否可能侵入中枢神经系统（CNS），这一特性此前已在朊病毒中得到证实，但....
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方案
所有涉及动物的实验程序均获得北莱茵-威斯特法伦州环境署（LANUV）动物保护委员会的批准。动物饲养和护理均按照标准条件进行，保持12小时光照/12小时黑暗循环，并可自由获取食物和水。
1. 动物模型
- 将半合子 Tg(Gfap-luc+/-) 小鼠与半合子 Tg(M83+/-) 小鼠杂交，以获得半合子双转基因 Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) 小鼠15,16。
- 使用实时 PCR 检测后代中编码人源 α-突触核蛋白的转基因，同时使用标准 PCR 检测萤火虫荧光素酶12,17。
- 在动物六至八周龄时进行接种。
2. 接种物制备
- 按照先前所述方法，在含有150 mM NaCl的20 mM Tris-HCl（pH 7.2）Tris缓冲盐水（TBS）中制备带有A53T突变的单体重组人源α-突触核蛋白14。
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结果
通过舌部或腹腔外周注射α-突触核蛋白朊病毒样物质，可在双转基因Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-)小鼠的中枢神经系统（CNS）中诱导神经病理学变化（表1 和 图1）。单次腹腔注射α-突触核蛋白纤维后，5只小鼠中有4只出现神经系统疾病，平均潜伏期为229 ± 17天。令人意外的是，经舌内注射α-突触核蛋白纤维后，5只小鼠中仅有1只在285天后出现中枢神经系统疾病。注射PBS的小鼠在420天的实验周期内未出现任何疾病。
通过Western blotting结合针对α-突触核蛋白Ser129位点的磷酸化特异性EP1536Y抗体进行的生化分析显示，经两种传播途径感染的患病动物，其脑和脊髓中均积聚了磷酸化且莎考斯（sarkosyl）不溶性的α-突触核蛋白聚集体（表2和图2
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讨论
将α-突触核蛋白纤维通过腹腔注射至Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-)小鼠体内，是一种可诱导神经系统疾病并伴随神经炎症的简便方法，能够重现突触核蛋白病的重要特征。类似地，舌部注射是α-突触核蛋白朊病毒样物质在转基因小鼠中实现神经侵袭的另一途径，但效率较低。我们选择在注射后420天终止实验，不能排除更多甚至全部注射纤维的小鼠在更晚时间点发病的可能性。此外，使用Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-)小鼠可实现对星形胶质细胞增生的无创可视化，为监测α-突触核蛋白神经侵袭在整个小鼠生命周期中所引发的炎症反应提供了一种简便方法。
一个关键步骤是接种物的制备。看似微不足道的因素，如聚集时间、超声处理时间、内毒素的含量，或用于注射的纤维数量，都可能通过影响错误折叠α-突触核蛋白的种子效应倾向而影响实验结果21。因此，在制备用于注射的接种物时，始终采用相同的条件非常重要。进行舌内注射时需考虑到，不仅舌下神经，其他颅.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Olga Sharma、Theresa Hundt 以及德国神经退行性疾病中心（DZNE）显微镜和动物设施部门工作人员提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗肌动蛋白抗体 | 默克密理博 | MAB1501 | |
| 抗α-突触核蛋白、磷酸化S129抗体 [pSyn#64] | 和光 | 015-25191 | |
| 抗α-突触核蛋白、S129位磷酸化抗体 [EP1536Y] | Abcam | ab51253 | |
| 抗GFAP抗体 | Dako | Z0334 01 | |
| 抗IBA-1抗体 | 和光 | 019-19741 | |
| 抗Sequestosome-1（p62）抗体 | Proteintech | 18420-1-AP | |
| 抗泛素抗体 [Ubi-1] | 默克密理博 | MAB1510 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Invitrogen | 14190169 | |
| 氯胺酮 | Ratiopharm | 100 mg/kg | |
| 赛拉嗪 | Ratiopharm | 10 mg/kg | |
| 27 G 注射器 | VWR | 613-4900 | |
| 异氟烷 | Piramal Healthcare | PZN 4831850 | |
| 脱毛膏 | Veet | ||
| Secureline 实验室标记笔 | Neolab | 25040 | |
| D-荧光素钾盐 | Acris | LK10000 | 30 mg/mL 储备液 |
| 恒温混匀仪 | Eppendorf | 5776671 | |
| Sonopuls Mini20 超声波破碎仪 | Bandelin | 3648 | |
| IVIS Lumina II 成像系统 | PerkinElmer | ||
| Living Image 3.0 软件 | PerkinElmer | ||
| Tg(M83)+/-) 小鼠或 B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J 小鼠 | 杰克逊实验室 | 004479 | |
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| 窄型纹式镊子 | 精细科学工具 | 11002-12 | |
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| 厚壁聚碳酸酯管 | 贝克曼库尔特 | 362305 | |
| NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi 蛋白凝胶 | 赛默飞世尔科技 | WG1401BOX | |
| HRP 标记抗体 | Cayman | Cay10004301-1 | |
| IR Dye 680 标记抗体 | LI-COR 生物科学 | 926-68070 | |
| SuperSignal West Dura 延长发光底物 | 赛默飞世尔科技 | 34075 | |
| Stella 3200 成像系统 | Raytest | ||
| Odyssey红外成像系统 | LI-COR 生物科学 | ||
| Tween 20 | MP Biomedicals | TWEEN 201 | |
| Triton X-100 | Sigma | SA/T8787 | |
| Immobilon-FL PVDF 膜 | 默克密理博 | IPFL00010 | |
| 二甲苯 | Sigma | Roth | |
| 过氧化氢 | Sigma | SA/00216763/000500 | 工作液 3% |
| 牛血清白蛋白（BSA） | 赛默飞世尔科技 | A3294-100G | |
| 山羊血清 | 赛默飞世尔科技 | PCN5000 | |
| 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | 赛默飞世尔科技 | D1306 | 工作稀释度 1:50,000 |
| Fluoromount 封片剂 | Omnilab | SA/F4680/000025 | |
| LSM700 共聚焦激光扫描显微镜 | 卡尔·蔡司 | ||
| HALT蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | 赛默飞世尔科技 | 10516495 | |
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| LSM700 共聚焦激光扫描显微镜 | 卡尔·蔡司 |
参考文献
- Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).
- Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Freeman, T. B. Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson's disease. Nat Med. Olanow, C. W. 14 (5)....
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重印与许可
