Test der Proteinkinase-Aktivität mit radioaktiv markiertem ATP
Summary
Proteinkinasen sind hochentwickelte Signalisierungsenzyme und Gerüste, die für die inter- und intrazelluläre Signaltransduktion kritisch sind. Wir stellen ein Protokoll zur Messung der Kinaseaktivität durch die Verwendung von radioaktiv markiertem Adenosintriphosphat ([γ- 32 P] ATP) vor, ein zuverlässiges Verfahren zur Erleichterung der zellulären Signalregulation.
Abstract
Proteinkinasen sind in der Lage, großräumige zelluläre Veränderungen in Reaktion auf komplexe Anregungen von Reizen zu regeln, und viel Aufwand wurde auf die Aufdeckung allosterischer Details ihrer Regulierung gerichtet. Kinasen umfassen Signalisierungsnetze, deren Defekte oft Markenzeichen von mehreren Formen von Krebs und verwandten Erkrankungen sind, was eine Assay-Plattform zur Manipulation von vorgeschalteten regulatorischen Faktoren und zur Validierung von Reaktionsanforderungen, die bei der Suche nach verbesserten Therapeutika kritisch sind, ermöglicht. Hier beschreiben wir einen basischen Kinase-Assay, der sich leicht an spezifische experimentelle Fragen anpassen lässt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Prüfung der Wirkungen von biochemischen und pharmakologischen Wirkstoffen, genetische Manipulationen wie Mutation und Deletion sowie Zellkulturbedingungen und Behandlungen zur Sonde Zell-Signalisierungsmechanismen. Dieser Assay nutzt radiomarkiertes [γ- 32 P] ATP, das quantitative Vergleiche und eine klare Visualisierung der Ergebnisse ermöglicht und mod sein kannFür die Verwendung mit immunpräzipitierten oder rekombinanten Kinase, spezifischen oder typisierten Substraten, über einen weiten Bereich von Reaktionsbedingungen.
Introduction
Proteinkinasen sind anspruchsvolle Enzyme, die für die Übertragung von zellulären Signalen in entsprechende Reaktionen kritisch sind 1 . Angesichts ihrer Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase und der Prävention oder Förderung von Krankheitszuständen 2 sind biochemische Methoden zur Beurteilung der Kinaseaktivität weiterhin mächtige Werkzeuge zur Abgrenzung der Einzelheiten der eukaryotischen Signalisierung 3 . Obwohl Strategien, die Phosphorspezifische Antikörper verwenden, in hohem Maße informativ waren hinsichtlich der Messung der Effekte verschiedener Behandlungsbedingungen auf den Zellsignalisierungsstatus 4 , ermöglicht ein Kinase-Assay die Messung der Wirkungen verschiedener Behandlungsbedingungen direkt in Bezug auf die enzymatische Aktivität einer Kinase von interessieren. Zwar gibt es mehrere Möglichkeiten für ähnliche Assays, die keine radioaktiven Materialien verwenden 5 , wir setzen uns weiterhin auf diese Methode zur robusten Quantifizierung der Ergebnisse. DortSind zwei typische Anwendungen dieses Assays, die beide aus verschiedenen Gründen wertvoll sind: der immunpräzipitierte (IP) Kinase Assay (Abbildung 1 ) und der rekombinante Proteinkinase-Assay (Abbildung 2 ).
Der IP-Kinase-Assay ist für die Identifizierung von Faktoren, die in der Lage sind, spezifische Proteinkinasen zu aktivieren, sowie die Bewertung von inhibitorischen Behandlungsbedingungen ungeeignet. Kurz gesagt wird eine Epitop-markierte Kinase von Interesse in kultivierte eukaryotische Zellen transfiziert, einer Vielzahl von Behandlungen unterworfen, immunpräzipitiert und auf die Fähigkeit untersucht, radioaktiv markiertes Phosphat in ein Modellsubstrat einzubauen ( z. B. Myelin-basisches Protein (MBP)). IP-Kinase-Assay kann auch ohne Rückgriff auf Überexpression durchgeführt werden, entweder durch Immunpräzipitation von endogenem Protein oder einer beliebigen Anzahl von Genom-Editing-Techniken. Da Behandlungen in Kultur verabreicht werden, kann dieses Verfahren Stimulationen erkennen, die durch mehrere vorgelagerte Faktoren übertragen werdenOder parallele Wege durch In-vitro- Auslesung. Ein wesentlicher Vorteil dieser Methode besteht darin, dass es keine Vorkenntnisse über direkte stromaufwärtige oder nachgeschaltete Faktoren oder Phosphorylierungsstellen erfordert. Darüber hinaus können, sobald spezifische Substrate für eine interessierende Kinase identifiziert worden sind, das gleiche Kinase-Assay-Protokoll mit rekombinanten Komponenten verwendet werden, um spezifische Aktivität gegenüber natürlichen Substraten zu messen und spezifische Phosphorylierungsstellen zu identifizieren, wenn sie mit der Massenspektrometrieanalyse kombiniert werden. Auf diese Weise identifizierte Standorte können mit Kinase-Assays unter Verwendung von Substratmutanten weiter validiert werden. Schließlich kann diese Methode auch zur Erkennung und Messung der Autophosphorylierung verwendet werden.
Das hier bereitgestellte Protokoll nimmt entweder ein optimiertes Proteinreinigungsschema oder Transfektionsverfahren zur Expression einer Affinitätsmarkierungskinase von Interesse in kultivierten Zellen an. Für detailliertere Ausstellungen der Transfektion, Lyse, Immunopräzipitation und Proteinreinigung protOcols, schlagen wir vor, auf Cold Spring Harbor Protocols 6 zu verweisen. Weitere Informationen zur Assayentwicklung und -veränderung finden Sie unter Proteinphosphorylierung: Ausgewählte Methoden in Enzymologie 7 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Kinasen sind eine vielfältige Familie von Proteinen, die in zahlreichen Kontexten umfangreiche Funktionalität entwickelt haben, und Kinase-Assays waren bei der Untersuchung mehrerer Signalproteine unglaublich nützlich und haben zu unserem aktuellen Verständnis der zellulären Kommunikation stark beigetragen. Bemerkenswerterweise wurde der gleiche Grundtest bei der Charakterisierung von zwei verschiedenen Kinasen trotz großer Unterschiede in Struktur und Aktivität verwendet. Die WNK1-Kinase enthält eine atyp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken allen aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Cobb-Labors für wertvolle Arbeit und Diskussionen und Dionne Ware für administrative Unterstützung. Diese Studien wurden von National Institutes of Health Grant R37 DK34128 und Welch Foundation Grant I1243 an MHC unterstützt
Materials
| Protein A Sepharose CL-4B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0963-03 |
| Radiolabeled [γ-32P] ATP | Perkin Elmer | NEG035C010MC |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | #1610737 |
| Radioactive shielding | Research Products International | BR-006 |
| R-250 dye (Coomassie) | Thermo Fisher | 20278 |
| Whatman Grade 3 qualitative filter paper | Whatman | 1003-917 |
| Slab gel vacuum dryer | Bio-Rad | Model 583 Gel Dryer #1651745 |
| Autorad marker | Agilent Technologies | 420201 |
| Phosphorescent ruler | Sigma Aldrich | R8133 |
| Phosphorescent dots | Sigma Aldrich | L5149 |
| Geiger counter | Ludlum | Model 3 with 44-9 detector |
| BioMax Cassette 8×10" | Carestream Health | 107 2263 |
| BioMax MS Film 8×10" | Carestream Health | 829 4985 |
| BioMax MS Intensifying Screen 8×10" | Carestream Health | 851 8706 |
| Medical/X-ray film processor | Konica Minolta | SRX-101A |
| Scintillation vials | Research Products International | 125500 |
| Scintillation fluid | MP Biomedicals | 188245305 |
| Beckman LS 6500 Scintillation counter | Beckman | LS 6500 |
References
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