zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparação para gravações eletrofisiológicas da Spinal Sensorial e Motor Neurons

Resumo

Este manuscrito descreve métodos para registos electrofisiolicos de neurónios espinais de embriões de peixe-zebra e larvas. A preparação mantém neurónios in situ e muitas vezes envolve a dissecção mínima. Estes métodos permitem o estudo electrofisiológico de uma variedade de neurónios espinais, a partir da aquisição inicial excitabilidade eléctrica através dos primeiros estádios larvares.

Resumo

Peixe-zebra, introduzido pela primeira vez como um modelo de desenvolvimento, ganharam popularidade em muitos outros campos. A facilidade de criação de um grande número de organismos em rápido desenvolvimento, combinada com a clareza óptica embrionário, serviu como atributos atraentes iniciais deste modelo. Ao longo das últimas duas décadas, o sucesso deste modelo foi ainda mais impulsionado por sua receptividade às telas de mutagênese em larga escala e pela facilidade de transgenia. Mais recentemente, de edição de gene abordagens ter aumentado a potência do modelo.

Para os estudos do neurodesenvolvimento, o embrião do peixe-zebra e larva de fornecer um modelo para que vários métodos podem ser aplicados. Aqui, vamos nos concentrar em métodos que permitem o estudo de uma propriedade essencial de neurônios, excitabilidade elétrica. A nossa preparação para o estudo electrofisiológico de neurónios espinais zebrafish envolve o uso de cola veterinário de sutura para fixar a preparação para uma câmara de registo. Métodos alternativos para gravaçãoa partir de embriões de peixe-zebra e larvas envolver a fixação da preparação para a câmara utilizando um pino fina de tungsténio ^{de 1, 2, 3, 4, 5.} Um pino de tungsténio é mais frequentemente usado para montar a preparação de uma orientação lateral, embora tenha sido usado para montar dorso-lateral larvas até ^4. A cola de sutura tem sido utilizado para montar os embriões e larvas em ambas as orientações. Usando a cola, uma dissecção mínima pode ser realizada, permitindo o acesso a neurónios espinais sem o uso de um tratamento enzimático, evitando assim qualquer dano resultante. No entanto, para as larvas, é necessário aplicar um breve tratamento com enzima para remover o tecido muscular em torno da medula espinhal. Os métodos aqui descritos têm sido utilizados para estudar as propriedades eléctricas intrínsecas de neurónios motores, interneurónios, e neurónios sensoriais em vários DevelopmentAl módulos ^{6, 7, 8, 9.}

Introdução

George Streisinger pioneira no uso de Danio rerio, vulgarmente conhecido como peixe-zebra, como um sistema modelo para a análise genética do desenvolvimento dos vertebrados ^10. O modelo oferece várias vantagens, incluindo: (1) criação de animais relativamente simples e de baixo custo; (2) a fertilização externa, permitindo um acesso fácil aos embriões desde os primeiros estádios de desenvolvimento; e (3) um embrião transparente, permitindo observações directas e repetidas de células, tecidos e órgãos, como eles formam.

Ao longo das décadas que se seguiram, vários avanços aumentou ainda mais o poder d....

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC; Office of Laboratory Animal Resources, Universidade do Colorado Anschutz Medical Campus).

1. Zebrafish Husbandry

1. Aumentar e manter o peixe-zebra adulto (Danio rerio) a 28,5 ° C em um / 14 h ciclo de luz de 10 h de escuro e com tratamento de água apropriado e troca ^52.
2. Elevar zebrafish embriões / larvas a 28,5 ° C em meio de embriões até que atinjam a fase desejado (por exemplo, 2 dpf).

2. Preparação de Dissecção Materiais

Resultados

Temos registos com sucesso a partir de neurónios Rohon-Beard em 17 hpf embriões através 7 dpf larvas (Figura 5A e 5B). Quando as células Rohon-Beard foram registados, a preparação foi montada do lado dorsal para cima. Essa montagem permite a identificação inequívoca de células Rohon-Beard com base nas suas posições dorsais superficiais e tamanhos grandes soma. A identificação é adicionalmente confirmada pelo potencial de membrana em repouso hiperpolariza.......

Discussão

Os métodos aqui descritos permitem a caracterização eléctrica e morfológica dos neurónios sensoriais e motores de embriões de peixes-zebra após dissecção mínima da medula espinhal. Neurônios permanecem saudáveis ​​por pelo menos 1 h, o limite de tempo imposto sobre essas gravações. Os neurónios foram registados utilizando a configuração de célula inteira padrão, bem como a partir de manchas nucleadas; este último método minimiza os problemas de espaço-de braçadeira que pode impedir um estudo detalhado biofísico de corre.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Filtro de vácuo/Garrafa de armazenamento, poro de 0,22 mm	Corning	431096
Seringa de 0,2 mm	Whatman	6780-2502
Tricaine	Sigma	A-5040	Etil 3-aminobenzoato metanossulfonato sal
&alfa;-bugarotoxina	Tocris	11032-79-4
Tetrodotoxina	Tocris	4368-28-9
Alexa-549 sal de hidrazina	Sondas moleculares	A-10438	corante fluorescente
Spin-X filtro de tubo de centrífuga	Corning	8161
Lâmina de microscópio de vidro	Fisher	12-550C
Sylgard silicone kit de elastômero	Dow Corning	184	placas de Petri de elastômero de silicone
	Falcon	351029
Capilares de vidro borossilicato	Harvard Apparatus	30-0038	diâmetros internos e externos de 0,78 e 1,0 mm (capilares de vidro de paredes finas)
Capilares de vidro borossilicato	Drummond Scientific	1-000-1000-100	diâmetros internos e externos de 1,13 e 1,55 mm (capilares de vidro de parede grossa)Encaixe
de polipropileno barpado em miniatura	Adesivo de tecido Cole-Palmer	6365-90
Vetbond	3M	1469SB
Collagenase XI	Sigma	C7657
Extrator de microeletrodos	Sutter Instruments	Modelo P-97
Amplificador	Molecular Devices	Axopatch 200B
Head stage	Molecular Devices	CV203BU
Micromanipulador motorizado	Tubulação Tygon	MP-285
	Fisher	14-169-1B	ID 1/16 IN, OD 1/8 IN e PAREDE 1/32 IN (tubulação flexível de laboratório)
Suporte de eletrodo	Molecular Devices	1-HC-U
Pharmaseal Torneiras de Três Vias	Baxter	K75
Digitizer	Axon Instruments	Digidata 1440A
Microscópio invertido	Zeiss	Axioskop2 FS mais
objetiva Achroplan de 40X/0,80W	Zeiss
Software de aquisição e análise de dados	Axon Instruments		PClamp 10 - Clampex e Clampfit
Extrator de micropipetas	Sutter Instruments	Modelo P-97
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Soluções de dissecação e gravação (em mM)
Todas as soluções, exceto a intracelular, são estáveis por ~ 2-3 meses quando filtradas (copos de filtro de 0,22 mm) e armazenadas em temperatura ambiente (RT).
A solução intracelular é filtrada (filtros de seringa de 0,2 mm) e armazenada congelada (-20 ° C) em pequenas alíquotas que são descongeladas individualmente no dia do uso.
Dissecção / Campainha' s solução			145 NaCl, 3 KCl, 1,8 CaCl2,2H2O, 10 HEPES; pH 7,4 (com NaOH)
Solução de registro			135 KCl, 10 EGTA-ácido, 10 HEPES; pH 7,4 (com KOH).
Solução de registro de banho (extracelular) / pinça			125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2< / sub>,2H2< / sub>O, 5 HEPES; pH 7,4 (com NaOH).
Solução de estoque de sal de hidrazina Alexa-594.			Prepare um estoque de 13,2 mM em ddH2O, alíquota (~100 µ l) e armazene a -20 ° C. Para uso, dilua a solução de estoque 132 vezes com solução de pipeta até uma concentração final de 100 mM. Após a diluição, filtre a solução de pipeta contendo Alexa-594  com um filtro de tubo de centrífuga.
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agentes imobilizadores
0,4% de sal de etilo 3-aminobenzoato de metanossulfonato (Tricaine)			Prepare uma solução estoque a 0,4% em 0,2 M Tris, pH 9 (0,4 g de Tricaína/100 mL 0,2 M Tris
Ajuste o pH para 7 com NaOH e armazene a -20 °C.
Para uso, dilua a solução estoque ~25 vezes em meio embrionário
250 mM &alfa;-bungarotoxina			Prepare um estoque de 250 mM em ddH2O (1 mg/500 mL), prepare 100 µ L alíquotas e sotre a -20 °C.
Para uso, dilua 2.500 vezes com solução extracelular até uma concentração final de 100 nM.
1 mM Tetrodotoxina			Prepare um estoque de 1 mM em ddH2O (1 mg/3 mL), prepare 100 µ L alíquotas e sotre a -20 °C.
Para uso, diluir 2.000 vezes com solução extracelular até uma concentração final de 500 nM.

da Sutter Instruments de pipeta (intracelular) de tensão e corrente