Summary
Здесь мы представляем количественный и масштабируемый протокол для выполнения целевых маломолекулярных экранов для киназных регуляторов наивного первичного плюрипотентного перехода.
Abstract
Эмбриональные стволовые клетки (ESCs) могут самообновляться или дифференцироваться во все типы клеток, явление, известное как плюрипотентность. Были описаны различные плюрипотентные состояния, называемые «наивными» и «примированными» плюрипотентностями. Механизмы, которые контролируют наивно-загрунтованный переход, плохо изучены. В частности, мы по-прежнему плохо информированы о протеинкиназах, которые указывают на наивные и загрунтованные плюрипотентные состояния, несмотря на увеличение доступности высококачественных инструментов для исследования функции киназы. Здесь мы описываем масштабируемую платформу для выполнения целевых маломолекулярных экранов для киназных регуляторов наивного первичного плюрипотентного перехода в ESC ESC мыши. Этот подход использует простые условия культивирования клеток и стандартные реагенты, материалы и оборудование для выявления и проверки ингибиторов киназ, которые до сих пор не оценивались с плюрипотентностью. Мы обсуждаем потенциальные применения этой технологии, включая экранирование других малых молекулТакие как все более сложные киназные ингибиторы и новые библиотеки эпигенетических инструментов.
Introduction
Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) обладают способностью к самообновлению или дифференцировке в любой тип клеток во взрослом теле, явление, известное как плюрипотентность 1 . Недавние свидетельства указывают на то, что существуют разные по своей природе плюрипотентные состояния, называемые «наивными» и «примированными» плюрипотентностями 2 . Наивные ESCs представляют собой состояние развития, подобное тому, которое наблюдается у эмбрионов преимплантации 3 . Напротив, примированные плюрипотентные ESCs готовы выйти из плюрипотентности и дифференцироваться в специализированные эмбриональные линии 4 , 5 .
Наивные и примированные плюрипотентные состояния отмечены различными регуляторными сетями генов. Наивная плюрипотентность характеризуется экспрессией ключевых факторов транскрипции плюрипотентности, таких как Nanog, Krueppel-подобные транскрипционные факторы (Klfs), Rex1 2 и Esrrb
MESC обеспечивают приемлемую модель для исследования механизмов, которые контролируют наивные первичные плюрипотентные переходы in vitro . При культивировании в лейкозном ингибиторном факторе (LIF) и эмбриональной бычьей сыворотке (FBS), mESCs подвергаются динамическому переходу между наивными и примированными плюрипотентными состояниями 9 , 10 . LIF-Jak-Stat3 сигнальные функции, направленные на развитие сети наивных генов 11 12 . Однако остается нерешенной задача систематической оценки роли протеинкиназ в определении отдельных плюрипотентных состояний.
Здесь мы описываем количественную и масштабируемую платформу, с помощью которой можно осуществлять целевые экраны с малыми молекулами для киназных регуляторов наивного первичного плюрипотентного перехода. Мы используем простые условия культивирования mESC и стандартные реагенты, материалы и оборудование, чтобы выявить и проверить ингибиторы киназы с до сих пор непогашенной способностью стабилизировать наивную плюрипотентность. Кроме того, мы обсуждаем потенциальные расширенные приложения для этой технологии, в том числе для скрининга других небольших коллекций молекул, таких как новые библиотеки ингибиторов, нацеленные на эпигенетические регуляторы.
Protocol
1. Сборка библиотек ингибиторов киназы малых молекул
- Объединение библиотек ингибиторов из общедоступных коллекций ингибиторов киназы, например Библиотека интегрированных сетевых клеточных сигнатур (LINCS) Гарвардской медицинской школы, целевая коллекция из 228 сильнодействующих и селективных ингибиторов киназы (http://lincs.hms.harvard.edu) , И набора ингибиторов протеинкиназы (PKIS), 376 сборной коллекции, собранной промышленными исследователями (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) 13 . В качестве альтернативы, собрать коллекцию ингибиторов киназы из коммерчески доступных соединений.
ПРИМЕЧАНИЕ. В нашей лаборатории мы собрали коллекцию из 72 мощных и селективных ингибиторов киназы инструмента, охватывающих 51 первичный целевой киназ, все из которых доступны из коммерческих источников. - Собирают ингибиторы киназы в 96-луночные планшеты для оптимальной высокопроизводительной обработки при множественных концентрациях (используйте 1, 0,1 а0,01 мМ). Включить в каждый планшет контрольные лунки, содержащие только ДМСО, и контрольные ингибиторы контроля PD173074 (FGFRi) и Ruxolitinib (JAKi), которые, как известно, способствуют развитию наивных и затравочных плюрипотентных состояний соответственно. Аннотируйте в электронной таблице или подобном программном обеспечении.
2. Условия и процедуры культивирования mESC для подготовки экрана
- Готовят 0,1% покрытые желатином 10 см чашки, добавляя 5 мл 0,1% (вес / объем) желатина к 10 см чашкам и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Аспирируйте желатин и дайте планшетам высохнуть в течение 2 мин.
- Культура любая стандартная линия mESC при 37 ° C 5% CO 2 на 0,1% покрытых желатином блюдах 10 см в стандартных средах mESC (см. Таблицу материалов ), содержащих 100 нг / мл GST-LIF, 10% фетальную сыворотку теленка и 5% сыворотки нокаута Замена. Каждый день заменяйте носитель и пропускайте mESC примерно на 80% слияния при разведении 1: 5-1: 10.
- Для прохода mESC, аспирата и промыть 5 мл оF фосфатно-солевой буфер (PBS) на пластину.
- Добавить 1 мл трипсина-ЭДТА (0,05% трипсина, 0,02% ЭДТК) на чашку mESC и инкубировать при 37 ° С в течение 10 мин.
- Ресуспендируют трипсинизированные клетки в 4 мл среды mESC и центрифугируют при 1200 об / мин в течение 5 мин.
- Тщательно ресуспендируют клеточный осадок в 5 мл среды mESC, пипетируя вверх и вниз, чтобы получить суспензию отдельных клеток.
- Считайте клетки, объединив суспензию клеток 10 мкл и 10 мкл трипанового синего (0,4%). Поместите в камеру подсчета клеток или используйте гемоцитометр и световой микроскоп.
- Семя 3 × 10 3 mESC на 0,1% покрытых желатином 96-луночных планшетах, конечный объем 100 мкл среды, используя многоканальную пипетку.
- Применяют ингибиторы киназы при разведении 1: 100 (1 мкл ингибитор добавляется к 100 мкл среды) с использованием многоканальной пипетки. Осторожно пипетируют среду для смешивания ингибитора и клеточной суспензии, затем дают клеткам оседать в вытяжном шкафу для ткани в течение 1 часа, чтобы обеспечить равномерное распределение акроSs поверхность покрытия. Культурные клетки в течение 48 ч без изменения среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: запасные пластины 1 / 0,1 / 0,01 мМ дают конечную концентрацию ингибитора 10/1 / 0,1 мкМ соответственно. Мы рекомендуем начать экран с конечной концентрацией 1 мкМ, чтобы обеспечить эффективное ингибирование первичных киназ-мишеней, в то же время минимизируя эффекты вне цели.
3. Анализ скрининга ингибиторов киназы
- Промывают 96-луночные планшеты mESC в 200 мкл PBS, используя многоканальный аспиратор и пипетки.
- Делают клеточные экстракты в 150 мкл лизирующего буфера (20 мМ Трис, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% NP-40 (об. / Об.), 0,5% дезоксихолата натрия (мас. / Об.), 10 мМ β-глицерофосфата , 10 мМ пирофосфата натрия, 1 мМ NaF, 2 мМ Na 3 VO 4 , полный коктейль-ингибитор протеазы).
- Осветляют экстракты центрифугированием при 1500 мкг в течение 30 мин в 96-луночных планшетах с V-дном.
- Иммобилизуйте 100 мкл супернатантов на нитроцелеЛюлозной мембраны с использованием 96-луночного вакуумного точечного блот-фильтра.
- Высушите мембрану и окрасьте 40 мл Ponceau S, чтобы обеспечить постоянный перенос.
- Промыть мембрану TBST и заблокировать TBST / 3% (вес / объем) молока.
- Инкубируйте в антителах Nanog и Dnmt3b при разведении 1: 1000 (об / об) в TBST / 3% (вес / объем) сухого молока в течение ночи.
- Промывают мембраны через 3 × 10 мин в TBST и инкубируют в 30 мл вторичных антител при разведении 1: 10000 (об. / Об.) В TBST / 3% (вес / объем) молоке.
- Разработка с использованием цифровой системы получения изображений с иммуноблоттингом.
ПРИМЕЧАНИЕ. Если возможно, используйте количественное флуоресцентное иммуноблоттинга для обнаружения Nanog и Dnmt3b. Однако фоновый сигнал для Dnmt3b с помощью иммуноблоттинга флуоресценции является слишком высоким. Поэтому используют 800 нм флуоресцентные антикроличковые (Nanog) и антимышиные-HRP (Dnmt3b) вторичные антитела.
4. Анализ экранных данных и валидация ингибиторов в качестве добросовестных регуляторов плюрипотентности
- Количественный анализ сигналов Nanog и Dnmt3b с использованием программного обеспечения для анализа иммуноблоттинга и импорт значений в электронную таблицу или подобное программное обеспечение. Рассчитайте отношение Nanog: Dnmt3b для всех образцов по сравнению с контролем DMSO. Также определите общий сигнал Nanog и Dnmt3b, чтобы гарантировать, что ингибиторы киназы не влияют на соотношение Nanog: Dnmt3b, изменяя жизнеспособность mESC.
- Используйте ранжированные соотношения Nanog: Dnmt3b для идентификации ингибиторов, которые способствуют наивной плюрипотентности (отношение Nanog: Dnmt3b выше, чем контроль) и загрунтованной плюрипотентности (соотношение Nanog: Dnmt3b ниже, чем контроль). Установите отключение при двукратном отклонении от контрольных значений и отфильтровывайте ингибиторы киназы, которые производят общий сигнал Nanog + Dnmt3b, который меньше50% контрольного значения ДМСО для создания списка высокой достоверности ингибиторов киназы, которые стабилизируют наивные (высокое отношение Nanog: Dnmt3b) и праймированные (низкое Nanog: Dnmt3b) плюрипотентные состояния.
- Проверяйте ингибиторы киназы, посеяв mESC на 2 × 10 5 клеток на 6 лунок в 2 мл среды и добавьте ингибиторы киназы при 1 мкМ в течение 48 часов, не меняя среду.
- Lyse mESCs в буфере для лизиса и анализируют экспрессию Nanog и Dnmt3b с помощью обычного SDS-PAGE иммуноблоттинга.
- Дальнейшая проверка обращений с помощью SDS-PAGE иммуноблоттинга для наивных маркеров плюрипотентности Klf2 и Klf4 и Oct4 для обеспечения сохранения плюрипотентности после 48-часовой обработки ингибитором.
Representative Results
Используя представленную здесь процедуру ( рис. 1 ), мы просматриваем библиотеку LINCS из 228 сильнодействующих и селективных ингибиторов киназы, чтобы идентифицировать те, которые модулируют плюрипотентность mESC. Библиотека готовится в концентрации 0,1 мМ для разведения 1: 100 и конечной концентрации скрининга 1 мкМ в mESC. Через 48 часов mESC лизировали и получали экстракты для количественного анализа дот-блоттинга экспрессии Nanog и Dnmt3b ( фиг. 2 , сверху). Результаты других скрининговых концентраций здесь не приводятся для краткости. Соотношение Nanog: Dnmt3b определяют для каждого ингибитора киназы, а соединения оценивают и применяют двухкратное отсечение ( рисунок 2 , снизу). Суммарный сигнал Nanog и Dnmt3b относительно контроля накладывается на ранжирование ингибитора и подвергается 0,5-кратному отсечению, чтобы обеспечить триагирование ингибиторов, которые показывают значительную токсичность mESC. Выберите ингибиторы киназы, которые стабилизируют наивные состоянияТе проверяются с использованием обычного иммуноблотинга Nanog / Dnmt3b ( рисунок 3 ). Первичные киназные мишени этих ингибиторов представлены в таблице 1 . Мы также демонстрируем применимость этого экрана для идентификации ингибиторов, которые стабилизируют загрунтованное состояние 14 .
Рисунок 1: Рабочий процесс для скрининга ингибиторов киназы, которые модулируют наивно-загрунтованный переход. MESC обрабатывали библиотекой ингибитора киназы 228 с конечной концентрацией 1 мкМ. Лизаты готовили и переносили на нитроцеллюлозные мембраны для иммунодот-блот-анализа, определяли уровни Nanog и Dnmt3b (фиг. Адаптировали из Williams и др. 14 ). Нажмите здесь, чтобы просмотреть все Arger версия этого рисунка.
Рисунок 2: Первичный плюрипотентный скрининг-анализ и идентификация ингибитора. (Top) Представитель Nanog и Dnmt3b иммунно дот-блот изображения. (Bottom) Определяли значения Nanog и Dnmt3b для каждого ингибитора киназы относительно контроля ДМСО и определяли отношения Nanog: Dnmt3b и общий относительный сигнал Nanog + Dnmt3b и оценивали ингибиторы по сравнению с контролем ДМСО. Установлено, что ингибиторы, которые обнаруживают изменение соотношения Nanog: Dnmt3b за 2-кратное пороговое значение выше или ниже контроля ДМСО, были идентифицированы как факторы, вызывающие наивную или примированную плюрипотентность. Порог в 2 раза ниже контроля ДМСО был установлен для ингибиторов сортировки, которые ставят под угрозу выживаемость mESC. Ингибиторы, выбранные для дальнейшей проверки, выделены. (Фигура адаптирована из Williams и др. 14 ).S / ftp_upload / 55515 / 55515fig2large.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Проверка выбранных хитовых соединений. MESC обрабатывали 1 мкМ AZD4547 (селективный ингибитор FGFR) или указанными ингибиторами, идентифицированными на экране на рисунке 2. Уровни Nanog: Dnmt3b определяли стандартным SDS-PAGE и иммуноблот-анализом. Численные значения относительных Nanog: Dnmt3b и Nanog + Dnmt3b указаны в таблице ниже, а ингибиторы, которые стабилизируют наивное плюрипотентное состояние, выделены зеленым цветом. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Соединение | Первичные цели | Другие цели | |
| AV-951 | VEGFR | ||
| HG-6-64-01 | ABL, BRAF, RET, CSF1R, EGFR, EPHA8, FGFR, FLT3, KIT, LOK, MAP4K1, p38b, MUSK, PDGFR, TAOK3, TNNI3K | ||
| WH-4-023 | Lck | Src | |
| R406 | Syk | ||
| GW-572016 | HER2 | EGFR | |
| KIN001-244 | PDK1 | ||
| WZ-4-145 | CSF1R, DDR1, EGFR, TIE1, PDGFR2 | ||
| WZ-7043 | CSF1R, DDR1, FGFR и TAO1 | ||
| GW786034 | VEGFR1 | VEGFR2, VEGFR3 &# 160; | |
| AZD-1480 | JAK2 | ||
Таблица 1: Отобранные соединения-хиты и их первичные киназные мишени.
Discussion
Здесь мы демонстрируем широко доступную методологию для исследования роли сигнальных путей киназы в регулировании наивного первичного плюрипотентного перехода. Это затрагивает ключевой вопрос в поле ESC. Хотя подходы с высокой пропускной способностью геномики и транскриптомикой обычно используются для идентификации ключевых регуляторов транскрипции наивных и примированных плюрипотентных состояний, выявление сетей сигнализации плюрипотентности оказалось сложным. Теперь мы предлагаем гибкую стратегию с использованием химических ингибиторов для идентификации киназ, которые контролируют наивный первичный плюрипотентный переход в mESC. Это зависит от простого оборудования, реагентов и материалов, которые доступны для большинства лабораторий, изучающих клеточную сигнализацию и биологию ESC. Критически важным для успеха этой платформы является наше развитие надежного анализа для количественной оценки перехода между наивными и примированными плюрипотентными состояниями. Установление этого анализа потребовало значительных итерационных модификаций на клеточной плазмеПлотность инкубации, время инкубации ингибитора и условия иммуноблоттинга.
Маломолекулярные подходы набирают силу для рационального использования в терапевтических применениях ЭСК 15 , 16 . Основная сила скрининга небольших молекул заключается в том, что составы инструментов разработаны и / или модифицированы для эффективного поглощения клетками. Эффективность трансфекции не является ограничивающей, и использование опасных систем доставки, таких как лентивирус, не является необходимым. Кроме того, ингибиторы часто ингибируют множественные изоформы в семействе киназ ( например, Fgfr1-4, Jak1-3), что позволяет преодолеть функциональную избыточность, которая препятствует генетическим / геномным интерференционным методам, таким как RNAi и CRISPR / Cas9. По мере того, как более эффективные и селективные соединения становятся доступными как из академических, так и из фармацевтических программ по обнаружению лекарств, малозначительные и плохо понятые киназы будут выдвинуты на передний план исследований ESC. Поэтому мы предлагаем, чтобы этотГрубый подход к отбору проб откроет новые возможности для исследований в основных сетях регулирования ESC.
Одно незначительное ограничение этой технологии состоит в том, что даже самые сильные и селективные ингибиторы малых молекул взаимодействуют и ингибируют множественные несвязанные киназы in vivo . Однако все более полные данные профилирования ингибиторов киназы позволяют легко идентифицировать функциональные мишени ингибиторов киназы (http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase -inhibitors). Наконец, в принципе, наша платформа может применяться для опроса любой небольшой коллекции молекул и / или клеточного анализа, для которого доступны высококачественные иммуноблоттинговые антитела. Это позволит изучить множественные регуляторные системы в регуляции плюрипотентности и облегчить идентификацию малых молекул-ингибиторов, которые изменяют различные клеточные процессы. В частности, мы предполагаем, что применение новых коллекций малых молекул, таких как эпигенКоторые разрабатываются Консорциумом структурной геномики (http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics), могут открыть новые новые регуляторы плюрипотентных переходов.
Disclosures
Авторы не заявляют о конфликтах интересов, возникающих в результате этого исследования.
Acknowledgments
CACW поддерживается кандидатской диссертацией в Медицинском исследовательском совете. GMF частично поддерживается Советом по исследованиям в области медицинских исследований New Investigator Award (MR / N000609 / 1) и исследовательским грантом Tenovus Scotland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mESC media | |||
| CCE mESCs | ATCC | ATCC SCRC-1023 | |
| DMEM Media | Gibco | 11965092 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | Final: 2 mM |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | Final: 50 U/ml |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Final: 0.1 mM |
| Leukemia Inhibitory Factor (GST fusion) | MRC-PPU reagents and services | Final: 100 ng/mL | |
| Leukemia Inhibitory Factor | Thermo | PMC9484 | Final: 100 ng/mL |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140050 | Final: 0.1 mM |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | Final: 1 mM |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Final: 5% |
| Defined Fetal Bovine Serum | Fisher | 10703464 | Final: 10% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TC materials | |||
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo | 25300054 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 1890 | |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | Thermo | 156545 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190136 | |
| V-bottom 96 well plates | Greiner Bio-one | 651261 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysis Buffer | |||
| Tris buffer | VWR | 103157P | |
| Sodium Chloride | VWR | 97061 | |
| EDTA | Sigma | E4884 | |
| 1% NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-100g | |
| β-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Sodium Pyrophosphate | Sigma | 13472-36-1 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | 450022 | |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Sigma | CO-RO | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Tween | Sigma | P1379-1L | |
| Milk Powder | Marvel | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Western Blotting | |||
| Protran BA 85 Nitrocellulose 0.45 &micor;M Pore size (20 cm x 20 cm Sheets) (25 Sheet) | GE | 10401191 | |
| Ponceau S | Sigma | P7170-1L | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laboratory Equipment | |||
| Minifold I System | GE | 10447850 | |
| ChemiDoc imager | BioRad | 1708280 | |
| LiCor Odyssey Imager | LiCor | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Nanog | Reprocell | RCAB001P | |
| Anti-Dnmt3b | Imgenex | IMG-184A | |
| IRDye 800CW Donkey anti-Rabbit | Licor | 926-32213 | |
| Anti-mouse-HRP | Cell Signalling Technology | 7076S | |
| Anti-Klf2 | Millipore | 09-820 | |
| Anti-Klf4 | R&D Systems | AF3158 | |
| Anti-Oct4 | Santa Cruz | sc-5279 |
References
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
- Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4 (6), 487-492 (2009).
- Boroviak, T., et al. Lineage-Specific Profiling Delineates the Emergence and Progression of Naive Pluripotency in Mammalian Embryogenesis. Developmental Cell. 35 (3), 366-382 (2015).
- Tesar, P. J., et al. New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells. Nature. 448 (7150), 196-199 (2007).
- Brons, I. G. M., et al. Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos. Nature. 448 (7150), 191-195 (2007).
- Festuccia, N., et al. Esrrb is a direct Nanog target gene that can substitute for Nanog function in pluripotent cells. Cell Stem Cell. 11 (4), 477-490 (2012).
- Ficz, G., et al. FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency. Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).
- Guo, G., et al. Klf4 reverts developmentally programmed restriction of ground state pluripotency. Development. 136 (7), 1063-1069 (2009).
- Chambers, I., et al. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).
- Findlay, G. M., et al. Interaction domains of Sos1/Grb2 are finely tuned for cooperative control of embryonic stem cell fate. Cell. 152 (5), 1008-1020 (2013).
- Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12 (13), 2048-2060 (1998).
- Kunath, T., et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development. 134 (16), 2895-2902 (2007).
- Elkins, J. M., et al. Comprehensive characterization of the Published Kinase Inhibitor Set. Nature Biotechnology. 34 (1), 95-103 (2016).
- Williams, C. A. C., et al. Erk5 Is a Key Regulator of Naive-Primed Transition and Embryonic Stem Cell Identity. Cell Reports. 16 (7), 1820-1828 (2016).
- Cao, N., et al. Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules. Science. 352 (6290), (2016).
- Zhang, M., et al. Pharmacological reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by signaling-directed transcriptional activation. Cell Stem Cell. 18 (5), 653-667 (2016).
