कैप्रेशेसी: प्लिमिड रिकवरी एंड प्रतिबंध एन्जाइम साइट इनर्सरेशन द्वारा कल्पना विधानसभा
Summary
यहां, हम प्लाज्मिड रिकवरी और प्रतिबंध एंजाइम साइट प्रविष्टि (सीएपीआरएआरआईआई) द्वारा चीमेरा विधानसभा को प्रस्तुत करते हैं, एक प्रतिलिपि एंजाइम साइटों को समानार्थक डीएनए दृश्यों और कार्यात्मक प्लाज्मिड वसूली में प्रवेश के आधार पर प्रोटोकॉल। यह प्रोटोकॉल प्रोटीन-कोडन जीन को फ्यूज़ करने के लिए एक तेज़ और कम लागत वाला तरीका है।
Abstract
यहां, हम प्लाज्मड वसूली और प्रतिबंध एंजाइम साइट प्रविष्टि (सीएपीआरएआरआईआई) द्वारा कल्पना का विधानसभा प्रस्तुत करते हैं। मूल प्लाज्मिड वसूली पद्धति की कई शक्तियों से कैप्रेसी लाभ और डीएनए ligation प्रतिक्रियाओं (चीरा विधानसभा के लिए आवश्यक) को कम करने के लिए प्रतिबंध एंजाइम पाचन का परिचय। इस प्रोटोकॉल के लिए, उपयोगकर्ता एक ही प्लाज्मिड (पीयूसी 18 या पीयूसी 1 9) में जंगली जीन को क्लोन करते हैं। एमिनो एसिड अनुक्रम क्षेत्रों के सिलिको चयन के बाद जहां चीमेर्स को इकट्ठा किया जाना चाहिए, उपयोगकर्ता उन सभी समानार्थक डीएनए दृश्यों को प्राप्त करते हैं जो उन्हें एनकोड करते हैं। तदर्थ पर्ल स्क्रिप्ट उपयोगकर्ताओं को सभी समानार्थक डीएनए दृश्यों को निर्धारित करने में सक्षम बनाता है। इस चरण के बाद, एक अन्य पर्ल स्क्रिप्ट सभी प्रतिरूप डीएनए दृश्यों पर प्रतिबंधित एंजाइम साइटों की खोज करता है। यह सिलिको विश्लेषण में पीयूसी 18/1 9 प्लास्मिड पर मिली एम्पीसिलीन प्रतिरोध जीन ( एपीआर ) का उपयोग किया जाता है। पीसीआर द्वारा wildtype और amp आर जीन को बाधित करने के लिए समानार्थी क्षेत्रों के अंदर उपयोगकर्ता ओलिगोन्यूक्लियोटाइजेशन का डिज़ाइन करता है। प्राप्त करने के बादपूरक और डीएनए टुकड़े शुद्ध, प्रतिबंध एंजाइम पाचन पूरा किया है। कल्पना के पूरक पूरक डीएनए टुकड़े ligating द्वारा हासिल की है। पीयूसी 18/1 वैक्टर का चयन कैप्रेसी के लिए किया जाता है क्योंकि वे तकनीकी लाभ, जैसे छोटे आकार (2,686 आधार जोड़े), उच्च प्रति संख्या, लाभप्रद अनुक्रमण प्रतिक्रिया सुविधाओं, और वाणिज्यिक उपलब्धता की पेशकश करते हैं। चिमारा विधानसभा के लिए प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग, खुजली वाली उत्पादों से उत्पन्न डीएनए पोलीमरेज़ की आवश्यकता को समाप्त करता है। कैप्रृसी प्रोटीन-कोडन जीन को फ्यूज़ करने के लिए एक तेज़ और कम लागत वाला तरीका है
Introduction
प्रोमेरोन फ़ंक्शन और / या बायोटेक्निकल प्रयोजनों के लिए चिमेरिक जीन असेंबली का व्यापक रूप से आणविक जीव विज्ञान में उपयोग किया गया है। फ्यूज़िंग जीन के लिए अलग-अलग तरीके मौजूद हैं, जैसे अतिव्यापी पीसीआर उत्पाद प्रवर्धन 1 , प्लाज्मिड रिकवरी 2 , मुताबिक़ पुनर्संयोजन 3 , सीआरआईएसपीआर-सीएस 9 सिस्टम 4 , साइट-निर्देशित पुनर्संयोजन 5 , और गिब्सन विधानसभा 6 । इनमें से प्रत्येक अलग-अलग तकनीकी लाभ प्रदान करता है; उदाहरण के लिए, अतिव्यापी पीसीआर डिजाइन की लचीलेपन, प्लास्मिड वसूली के दौरान निर्माण के विवो चयन में, या सीआरआईएसपीआर-सीएस 9 और गिब्सन सिस्टम की उच्च दक्षता। दूसरी ओर, इनमें से कुछ तरीकों का पालन करते समय कुछ कठिनाइयां पैदा हो सकती हैं; उदाहरण के लिए, पहले दो दृष्टिकोण कुंद-समाप्त डीएनए टुकड़ों पर भरोसा करते हैं, और इन प्रकार के उत्पादों की बाध्यता स्टिक की तुलना में तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकती हैकेआई-एंड लैज। साइट-निर्देशित पुनर्संयोजन, मूल पर अतिरिक्त डीएनए दृश्यों (निशान) के निशान को छोड़ सकता है, जैसे कि क्रय-लॉक्स सिस्टम 5 । सीआरआईएसपीआर-सीएस 9 कभी-कभी लक्ष्य साइट 4 के अलावा अन्य जीनोम क्षेत्रों को भी संशोधित कर सकता है।
यहां, हम प्लाज्मिड रिकवरी और प्रतिबंध एंजाइम साइट सम्मिलन (सीएपीआरआरएसआई) द्वारा चीमे विधानसभा की शुरुआत करते हैं, प्रोटीन-कोडिंग जीन के लिए एक प्रोटोकॉल है जो प्लाज्मिड रिकवरी विधि (पीआरएम) को समानार्थक डीएनए अनुक्रमों पर प्रतिबंध एंजाइम साइटों के सम्मिलन के साथ जोड़ती है, जिससे लगी दक्षता बढ़ जाती है । अमीनो एसिड अनुक्रम अखंडता को सुनिश्चित करने के लिए, प्रतिबंध एंजाइम साइट समानार्थक डीएनए अनुक्रम फैला हुआ पर डाला जाता है। CAPPRESI के लाभों में यह है कि यह सामान्य प्रयोगशाला अभिकर्मकों / उपकरण ( जैसे , एंजाइम, सक्षम कोशिका, समाधान, और थर्मोसायक्लर) का उपयोग करके किया जा सकता है और यह त्वरित परिणाम दे सकता है (जब उचित एंजाइमों का उपयोग किया जाता है)। प्रतिबंध पर भरोसाएंजाइम साइटें, जो समानार्थक डीएनए अनुक्रमों से उभरती हैं, वह ब्याज की प्रोटीन के अंदर सटीक संलयन अंक के चयन को सीमित कर सकती हैं। ऐसे मामलों में, लक्षित जीन को ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स ओवरलैप करने के जरिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, और प्रतिबंध एंजाइम साइटें वेक्टर के प्रतिरोध जीन पर डाली जाएंगी।
CAPRRESI में सात सरल चरणों ( चित्रा 1 ) शामिल हैं: 1) क्लोनिंग वेक्टर, पीयूसी 18 या पीयूसी 1 9 6 का चयन ; 2) जंगली सूचियों के सिलिको विश्लेषण में फ्यूज किया जाना; 3) चिमारा विधानसभा और प्लाज्मिड विघटन के लिए क्षेत्रों को तोड़ने का चयन; 4) प्रतिबंध एंजाइम साइटों युक्त समानार्थक डीएनए दृश्यों के सिलिको पीढ़ी में; 5) चयनित प्लास्मिड में जंगली जीनों के स्वतंत्र क्लोनिंग; 6) पीसीआर द्वारा प्लास्मिड व्यवधान, प्रतिबंध एंजाइम पाचन के बाद; और 7) डीएनए बंधन और बैक्टीरियल परिवर्तन का उपयोग करके प्लाज्मिड वसूली। इस तकनीक द्वारा उत्पादित चिमेरिक जीन को सत्यापन किया जाना चाहिएIth अनुक्रमण
पीयूसी 18/1 वैक्टर क्लोनिंग और चिमरा विधानसभा के लिए तकनीकी लाभ प्रदान करते हैं, जैसे छोटे आकार ( यानी, 2,686 आधार जोड़े), उच्च प्रति संख्या, लाभप्रद अनुक्रमण प्रतिक्रिया सुविधाओं, और वाणिज्यिक उपलब्धता 7 । यहां, एस्चेरिशिया कोलाई मेजबान को चीमेरे को इकट्ठा करने और संभालना था क्योंकि बैक्टीरिया की संस्कृतिएं सस्ता हैं और तेजी से बढ़ती हैं यह देखते हुए, अंतिम लक्ष्य प्लास्मिड में संलयन टुकड़ों के बाद क्लोनिंग की आवश्यकता होगी ( उदाहरण के लिए, स्तनधारी कोशिकाओं में बैक्टीरिया या पीसीएमवी में पीआरके 415 के रूप में अभिव्यक्ति वैक्टर)।
दो प्राथमिक सिग्मा कारक जीनों को फ्यूज़ करने के लिए कैप्रृसी का परीक्षण किया गया था: ई। कोलिपरोडी और राइज़ोबियम एट्लिसिगा । प्राथमिक सिग्मा कारक हैं आरएनए पोलीमरेज़ उप-इकाई जो ट्रांसक्रिप्शन दीक्षा के लिए जिम्मेदार हैं, और वे चार डोमेन ( यानी , σ1, σ2, σ3, और σ4) 8 से मिलकर काम करते हैं। एमिनो एसिड अनुक्रम लंबीRpoD और siga द्वारा एनकोड प्रोटीन एच क्रमशः 613 और 685 हैं। आरपीओडी और सिगा शेयर 48% पहचान (98% कवरेज) इन प्राथमिक सिग्मा कारकों को σ2 और σ3 क्षेत्रों के बीच दो पूरक टुकड़ों में विभाजित किया गया था। इस डिजाइन के अनुसार दो चिरागिक जीन को इकट्ठा किया गया है: कल्पना 01 (आरपो डीसी 1-σ2 + सिगैर -3-σ4) और चीइमा 02 (सिगएसर 1-σ2 + आरपीओडी -3 3) डीएनए संलयन उत्पादों को क्रमशः द्वारा सत्यापित किया गया।
Protocol
Representative Results
Discussion
सीएपीआरआरएसआई को पीआरएम 2 के विकल्प के रूप में डिजाइन किया गया था। मूल पीआरएम एक शक्तिशाली तकनीक है; यह चयनित जीन के किसी भी हिस्से के साथ डीएनए दृश्यों के संलयन के लिए अनुमति देता है। पीआरएम क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम कांज़ोजो नेसिओनल डी सेनेसीया वाई टेकनोलॉजिआ, कोंकायटी, मैक्सिको (अनुदान संख्या 154833) और यूनिवर्सिडैड नेसिअनल ऑटोनोमा डी मेक्सिको द्वारा समर्थित था लेखक अपने प्रशासनिक और तकनीकी सलाह के लिए विक्टर गोंजालेज़, रोजा आई। संतैमारिया, पेट्रीसिया बस्टोस और सोलएडड जुआरेज़ को धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304011 | Produces a mix of blunt/3’-A overhang ended PCR products |
| High pure plasmid isolation kit | Roche | 11754785001 | Used for all plasmid purification reactions |
| High pure PCR product purification kit | Roche | 11732676001 | Used for all PCR purification reactions from agarose gels |
| AflII restriction enzyme | New England Biolabs | R0520L | Recognizes sequence 5’-CTTAAG-3’ and cuts at 37 °C |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3142L | Recognizes sequence 5’-GGTACC-3’ and cuts at 37 °C |
| SpeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3133L | Recognizes sequence 5’-ACTAGT-3’ and cuts at 37 °C |
| XbaI restriction enzyme | New England Biolabs | R0145L | Recognizes sequence 5’-TCTAGA-3’ and cuts at 37 °C |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A0166-5G | Antibiotics |
| Nalidixic acid | Sigma Aldrich | N8878-5G | Antibiotics |
| Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625-1KG | Bacterial cell culture |
| Casein peptone | Sigma Aldrich | 70171-500G | Bacterial cell culture |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888-1KG | Sodium chloride |
| Agar | Sigma Aldrich | 05040-1KG | Bacterial cell culture |
| XbaI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0684 | Fast digest XbaI enzyme |
| KpnI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0524 | Fast digest KpnI enzyme |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Fast DNA ligation kit |
| AflII restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0834 | Fast digest AflII enzyme |
| SpeI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD1253 | Fast digest SpeI enzyme |
References
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