Descrevemos um método para a análise qualitativa e quantitativa da formação de grânulos de estresse em células de mamíferos após as células serem desafiadas com bactérias e vários estresses diferentes. Este protocolo pode ser aplicado para investigar a resposta do grânulo do estresse celular em uma ampla gama de interações hospedeiro-bacteriana.
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Artigo de método
Análise de imunofluorescência da formação de grânulos de estresse após o desafio bacteriano de células de mamífero
Neste artigo
Resumo
Resumo
A imagem fluorescente de componentes celulares é uma ferramenta eficaz para investigar interações hospedeiro-patógeno. Os agentes patogênicos podem afetar muitas características diferentes das células infectadas, incluindo a ultraestrutura orgânica, a organização da rede do citoesqueleto, bem como processos celulares, como a formação de grânulos de estresse (SG). A caracterização de como os patógenos subvertem os processos do hospedeiro é uma parte importante e integral do campo da patogênese. Embora os fenótipos variáveis possam ser facilmente visíveis, a análise precisa das diferenças qualitativas e quantitativas nas estruturas celulares induzidas pelo desafio dos patógenos é essencial para definir diferenças estatisticamente significativas entre amostras experimentais e de controle. A formação de SG é uma resposta de estresse conservada de forma evolutiva que leva a respostas antivirais e tem sido investigada por meio de infecções virais 1 . A formação de SG também afeta as cascatas de sinalização e pode ter outras conseqüências ainda desconhecidas2 . A caracterização desta resposta de estresse a agentes patogênicos que não sejam vírus, como patógenos bacterianos, é atualmente uma área de pesquisa emergente 3 . Por enquanto, a análise quantitativa e qualitativa da formação de SG ainda não é rotineiramente utilizada, mesmo nos sistemas virais. Aqui, descrevemos um método simples para induzir e caracterizar a formação de SG em células não infectadas e em células infectadas com um patógeno bacteriano citosólico, o que afeta a formação de SGs em resposta a vários estresses exógenos. A análise da formação e composição do SG é conseguida utilizando vários marcadores de SG diferentes e o plug-in do detector de pontos da ICY, uma ferramenta de análise de imagens de código aberto.
Introdução
A visualização das interações hospedeiro-patógeno em um nível celular é um método poderoso para obter informações sobre estratégias patogênicas e para identificar caminhos celulares chave. Na verdade, os agentes patogênicos podem ser usados como ferramentas para identificar alvos ou estruturas celulares importantes, pois os agentes patogênicos evoluíram para subverter processos celulares centrais como uma estratégia para sua própria sobrevivência ou propagação. A visualização de componentes celulares pode ser conseguida por proteínas de hospedeiro marcadas fluorescentemente com expressão de forma recombinante. Embora isso permita uma análise em tempo real, a geraçã....
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Protocolo
1. Preparação de bactérias e células hospedeiras
- Transferir a tampa de vidro de 12 ou 14 mm em placas de 24 ou 12 poços, respectivamente, com uma pinça estéril, contando um poço por condição experimental. Esterilize-os por tratamento UV em um capuz de cultura de tecidos por 15 min.
NOTA: Incluir poços de controle para desafio bacteriano e para indução de SG por estresses exógenos. - Para uma placa de 24 poços com lamelas de 12 mm, semente 1 x 10 5 células de mamífero ( por exemplo, células HeLa) em lamínulas; Pressione as lamelas para baixo com uma ponta de pipeta estéril. As células de células aderem durante a noite a 37....
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Resultados
Para explicar e demonstrar o protocolo descrito neste manuscrito, caracterizamos a imagem de SGs induzidos por clotrimazol em células HeLa infectadas ou não com o patógeno citosólico S. flexneri . Um esboço do procedimento é apresentado na Figura 1 e inclui S. flexneri virulento e avirulento listado em placas de Red Congo, preparação de bactérias, infecção, adição de estresse ambiental, fixação e coloração de amostras, imagem de amostra e q.......
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Discussão
O protocolo aqui descrito descreve a indução, localização e análise de SGs em células não infectadas e células infectadas com o patógeno citosólico S. flexneri na presença ou ausência de estresse exógeno. Com o uso de software de imagem livre, os protocolos permitem a análise qualitativa e quantitativa precisa da formação de SG para identificar e abordar de forma estatística as diferenças em determinados fenótipos.
Existem vários passos críticos dentro do protocolo para a infecção, .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
O PS é um destinatário da subvenção do Grand Challenge de Bill e Melinda Gates OPP1141322. O PV foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado da mobilidade pós-doutora da Fundação Nacional da Ciência Nacional da Suíça e uma bolsa de pós-doutorado Roux-Cantarini. O PJS é suportado por uma concessão HHMI e ERC-2013-ADG 339579-Decrypt.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anticorpos Primários | |||
| eIF3b (N20), cabra de origem | Santa Cruz | sc-16377 | Marcador SG robusto e amplamente utilizado. A coloração citosólica permite o delineamento celular. Diluição 1:300 |
| eIF3b (A20), cabra de origem | Santa Cruz | sc-16378 | O mesmo alvo do eIF3b (N20) e em nossas mãos era idêntico ao eIF3b (N20). Diluição 1:300 |
| eIF3A (D51F4), coelho de origem (MC: monoclonal) | Sinalização Celular | 3411 | Parte do complexo multiproteico eIF3 com eIF3b . Diluição 1:800 |
| eIF4AI, origem cabra | Santa Cruz | sc-14211 | Recomendado por (Ref # 13). Diluição 1:200 |
| eIF4B, coelho de origem | Abcam | ab186856 | Bom marcador de grânulos de tensão em nossas mãos. Diluição 1:300 |
| eIF4B, coelho de origem | Sinalização Celular | 3592 | Recomendado pela Ref # 13. Diluição 1:100 |
| eIF4G, coelho de origem | Santa Cruz | sc-11373 | Marcador SG amplamente utilizado. (Ref # 13): pode não funcionar bem em linhagens de células de camundongos. Diluição 1:300 |
| G3BP1, coelho de origem (MC: monoclonal) | BD Biosciences | 611126 | Marcador SG amplamente utilizado. Diluição 1:300 |
| Tia-1, origem caprino | Santa Cruz | sc-1751 | Marcador SG amplamente utilizado. Também pode ser encontrado em corpos P quando SG estão presentes (Ref # 13). Diluição 1:300 |
| Anticorpos secundários conjugados com Alexa | |||
| A488 anti-cabra, burro de origem | Thermo Fisher | A-11055 | Absorvido em cruz. Diluição 1:500 |
| A568 anti-cabra, burro de origem | Thermo Fisher | A-11057 | Absorvido em cruz. Diluição 1:500 |
| A488 anti-rato, burro de origem | Thermo Fisher | A-21202 | Diluição 1:500 |
| A568 anti-rato, burro de origem | Thermo Fisher | A10037 | Diluição 1:500 |
| A647 anti-rato, burro de origem | Thermo Fisher | A31571 | Diluição 1:500 |
| A488 anti-coelho, burro de origem | Thermo Fisher | A-21206 | Diluição 1:500 |
| A568 anti-coelho, burro de origem | Thermo Fisher | A10042 | Diluição 1:500 |
| Outros Reagentes | |||
| Shigella flexneri | Disponível em vários laboratórios mediante solicitação | ||
| Caldo de caseína triptona de soja (TCS) | BD Biosciences | 211825 | Meio de crescimento padrão para Shigella, aplicação - crescimento bacteriano |
| Ágar | TCS BD Biosciences | 236950 | Ágar de crescimento padrão para Shigella, aplicação - crescimento bacteriano |
| Vermelho do Congo | SERVA Electrophoresis GmbH | 27215.01 | Ferramenta de destriminação para Shigell que perderam o plasmídeo de virulência, aplicação - crescimento bacteriano |
| Poli-L-Lisina (PLL) | Sigma-Aldrich | P1274 | Útil para revestir bactérias para aumentar a infecção, aplicação - infecção |
| Gentamicina | Sigma-Aldrich | G1397 | Morte seletiva de bactérias extracelulares, mas não citosólicas, aplicação - infecção |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | Tampão de PH útil quando as células são incubadas em RT, aplicação - cultura de células |
| Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) | Life Technologies | 31885 | Meio de cultura padrão para células HeLa, aplicação - cultura de células |
| Soro de bezerro fetal (FCS) | Biowest | S1810-100 | Suplementação de 5% usada para meio de cultura de células HeLa, aplicação - cultura de células |
| Aminoácidos não essenciais (NEAA) | Life Technologies | 11140 | diluição 1:100 usada para meio de cultura de células HeLa, aplicação - cultura de células |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Diluente de reagente, aplicação - cultura de células |
| Arsenito | de sódioSigma-Aldrich | S7400 | Potente indutor de grânulos de estresse (Nota: altamente tóxico, manuseio e descarte especiais necessários), aplicação - indutor de estresse |
| Clotrimazol | Sigma-Aldrich | C6019 | Potente indutor de grânulos de estresse (Nota: perigo para a saúde, manuseio e descarte especiais necessários), aplicação - indutor |
| de estresse Paraformaldeído (PFA | Microscopia Eletrônica Scences | 15714 | 4% PFA é usado para fixação padrão de células, aplicação - fixação |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Usado a 0,03% para permeabilização de células hospedeiras antes da coloração imunofluorescente, aplicação - permeabilização |
| A647-faloidina | Thermo Fisher | A22287 | A diluição é de 1:40, melhor adicionada durante a coloração secundária de anticorpos, aplicação - coloração |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Coloração de ácido nucleide usada para visualizar tanto o núcleo do hospedeiro quanto as bactérias, aplicação - coloração |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | BR701501 | Filme de parafina útil para coloração imunofluorescente de lamínulas, aplicação - coloração |
| Prolong Gold | Thermo Fisher | 36930 | Meio de montagem robusto que funciona bem para a maioria dos fluoróforos, aplicação - montagem |
| Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Meio de montagem barato e robusto que funciona bem para a maioria dos fluoróforos, aplicação - montagem |
| de placa de cultura de células de 24 poços | Placas de cultura de tecidos padrão Sigma-Aldrich | CLS3527 | aplicação - cultura de células |
| 12 mm lamínulas de vidro | NeuVitro | 1001/12 | Suporte de cultura de células para aplicações imunofluorescentes, aplicação - pinça de suporte celular |
| Sigma-Aldrich | 81381 | Meio de montagem barato e robusto que funciona bem para a maioria dos fluoróforos, aplicação - montagem | |
| Programas e Equipamentos | |||
| Prism | GraphPad Software | Análise de dados e programa gráfico com opções robustas de teste estatístico, aplicação - análise de dados | |
| Leica SP5 | Leica Microsystems | Microsope confocal, aplicação - imagem aquisição | |
| Imaris | Bitplane | Professional programa de análise de imagem, aplicação - análise de dados | |
| Excel | Microsoft | Programa de análise de dados e gráficos, aplicação - análise de dados |
Referências
- Reineke, L. C., Lloyd, R. E. Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection. Virology. 436 (2), 255-267 (2013).
- Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase. Trends Biochem Sci. 38
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Reimpressões e permissões
