Analyse des molécule laser Localisés psoralène adduits

Résumé

Les lasers sont fréquemment utilisés dans les études de la réponse cellulaire aux dommages de l'ADN. Cependant, ils génèrent des lésions dont l'espacement, la fréquence et les collisions avec les fourches de réplication sont rarement caractérisés. Nous décrivons ici une approche qui permet la détermination de ces paramètres avec réticule laser localisé interbrins.

Résumé

L'ADN réponse aux dommages (DDR) a été largement caractérisé en études de cassures double brin (CDB) induit par micro irradiation par faisceau laser dans les cellules vivantes. Le DDR à l'hélice de distorsion modifications de l'ADN covalentes, y compris des reticulations entre brins d'ADN (ICL), ne sont pas aussi bien définie. Nous avons étudié la DDR stimulée par ICL, localisée par photoactivation laser de psoralènes immunotagged, dans les noyaux des cellules vivantes. Afin de répondre à des questions fondamentales sur la distribution de produits d'addition et de rencontres de la fourche de réplication, nous avons combiné la localisation laser avec deux autres technologies. des fibres d'ADN sont souvent utilisés pour afficher la progression des fourches de réplication par immunofluorescence d'analogues nucléosidiques incorporés pendant de courtes impulsions. points Immunoquantum ont été largement utilisés pour l'imagerie seule molécule. Dans la nouvelle approche, les fibres d'ADN de cellules portant ICL localisée au laser sont étalées sur des lames de microscope. Les ICL marqués sont affichés avec des points de immunoquantum et ee distances inter-lésion déterminée. les collisions de la fourche de réplication avec ICL peuvent visualiser et différents modèles de rencontre identifiés et quantifiés.

Introduction

ADN est sous attaque constante des agents exogènes tels que le rayonnement, la lumière ultraviolette, les toxines environnementales, les produits de combustion, etc. De plus, il est également attaqué par des espèces radicalaires endogènes produits par le métabolisme oxydatif. Tous ces éléments ont le potentiel de perturber chimiquement ou physiquement l'intégrité de l' ADN ^1. Perturbations dans le génome peut activer l'ADN réponse Damage (DDR), un recrutement et cascade post traductionnelles avec des centaines, voire des milliers, de protéines et microARN impliqués dans la réparation des lésions, la régulation du cycle cellulaire, ....

Protocole

1. Préparation de Dig-TMP

1. Mélanger 50 mg (0,18 mmoles) de 4'-chlorométhyl-4,5' , 8-triméthylpsoralène et 590 mg (2,7 mmoles) de 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-amine dans 25 ml rond sec flacon -bottom sous azote. Ajouter 10 ml de toluène et reflux pendant 12 h. Retirer le solvant dans un évaporateur rotatif sous pression réduite.
   1. Purifier le résidu par Chromatographie sur colonne éclair sur gel de silice. Eluer la colonne avec du chloroforme, de methanol, et 28% de solution d'ammoniac (9: 1: 0,5). Evaporer le solvant dans un évaporateur rotatif sous pression réduite, et récupérer le pur....

Résultats

Laser Dig-TMP (figure 1A) localisées ICL peuvent être affichées par immunofluorescence contre le Dig-étiquette liée à la psoralène. Bien que le laser peut être dirigé pour frapper dans une zone de contour quelconque, rayures ne sont pas des formes « naturels » dans les cellules, et les signaux légitimes peuvent être facilement distingués des artefacts dus à une liaison non spécifique par des anticorps primaires ou secondaires. Cette fonction est utile lors de l'utili.......

Discussion

La technologie de localisation laser nécessite l'utilisation de cellules adhérentes avec des noyaux qui sont visibles en microscopie en champ clair. Nous avons essayé de fixer les cellules non adhérentes, telles que les lymphocytes primaires, ou des cellules cultivées faiblement adhérentes telles que AD293, à la surface du verre avec des préparations adhésives des cellules tels que la polylysine ou de collagène, ou des mélanges plus complexes. Bien que ces traitements peuvent lier les cellules à la surface, nous con.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Digoxigénine NHS ester	Sigma-Aldrich	11333054001
Chloro-psoralène	Berry and Associates	PS 5000
diaminoglycol	Sigma-Aldrich	369519	4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine
Chloroform	Acros Organics	423550040
Méthanol	Fisher Scientific	A4524
Solution d’ammonium	Sigma-Aldrich	5002
plaques TLC	Analtech, Inc.	P02511
Colonne en verre Flass 24/40, 100 mL	Chemglass Life Sciences	CG-1196-02
Microscope confocal à disque rotatif Nikon T2000_E2, équipé d’une platine automatisée et d’une chambre de contrôle de l’environnement et d’un porte-plaque	Perkin Elmer		avec logiciel Volocity
Micropoint Galvo  ;	Andor Technologies		avec un laser pulsé à l’azote  ;
pile à colorant	Andor Technologies	MP-2250-2-365
365 colorant	Andor Technologies	MP-27-365-DYE
IdU  ;	Sigma-Aldrich	17125
Plaques botomm en verre de 35 mm 1,5 lamelle, diamètre du verre de 10 mm, lames	Matek	P35G-1.5-10-C
Pièce	d’approvisionnement New Comer	# 5070	New Silane
Slides Anticorps anti BrdU de souris (IdU)	BD Biosciences	347580	1 sur 40
Anticorps anti BrdU pour rat (CldU)	Abcam	ab6326	1 sur 200& nbsp ;
Anticorps anti-Dig pour lapin	ThermoFisher Scientific	710019	1 sur 200
Q-dot 655 chèvre anti IgG Rabbit ThermoFisher	Scientific	Q-11421MP	1 sur 5 000
AF647- chèvre anti Rat IgG	Jackson Immunoresearch	112-605-167	1 sur 100
AF488-chèvre anti souris IgG	Jackson Immunoresearch	115-545-166	1 sur 100
Zeiss épifluorescent microscope A200	Zeiss		; avec logiciel Axiovision
Filtre Q-dot 655	Chroma	39107

de microscope non revêtues