एक<em> विट्रो में</em> ट्यूबरकुलोसिस घावों में ड्रग एन्डेन्टेशन की भविष्यवाणी करने वाली केसम बाइंडिंग परख
Summary
यहां हम एक तेजी से संतुलन डायलिसिस (लाल) पद्धति का वर्णन करते हैं जो फुफ्फुसीय तपेदिक के घावों और गुहा से जुड़ी दवाओं को बाध्यकारी मानते हैं। प्रोटोकॉल का उपयोग फेनो मैक्रोफेज-व्युत्पन्न मैट्रिक्स के साथ भी किया जाता है जो केस्यूम के लिए एक प्रभावी सरोगेट है।
Abstract
तपेदिक रोग के उन्मूलन के लिए दवा के नियमों की आवश्यकता होती है जो जटिल फुफ्फुसीय घावों के कई परतों को घुसना कर सकती हैं। कैविटी और घावों के मामलों के मामले में दवा वितरण विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि वे ड्रग-सहिष्णु बैक्टीरिया के उप-जनसंख्या को भी बंद करते हैं जिन्हें सामान्यतया सामान्यतः पर्सर्स कहा जाता है। क्षयरोग संबंधी घावों में मादक द्रव्यों के सेवन के माप के मौजूदा तरीकों में जैव-फार्माकोकाइनेटिक अध्ययनों में जैव-विश्लेषणात्मक या इमेजिंग तकनीकों के साथ महंगा और समय-उपभोक्ता शामिल है। केस्यूम के लिए बाध्यकारी मादक पदार्थों में इन विट्रो मापन को ऐसी तकनीक के विकल्प के रूप में प्रस्तावित किया गया था क्योंकि इस बाध्यकारी ने केसम के माध्यम से दवा के अणुओं के निष्क्रिय प्रसार को बाधा पहुंचाई है। रैपिड संतुलन डायलिसिस प्लाज्मा प्रोटीन और ऊतक बाध्यकारी अध्ययन करने के लिए एक तेज और विश्वसनीय प्रणाली है। इस प्रोटोकॉल में, हम एक तेजी से संतुलन डायलिसिस (आरईडी) डिवाइस का इस्तेमाल करते थे जो कि केस्यूम के होमोजनेनेट के लिए मादक पदार्थों को बाध्य करने के लिए इस्तेमाल होता हैतपेदिक-संक्रमित खरगोशों के घावों और गुहा से एड प्रोटोकॉल यह भी बताता है कि केसियम के स्थान पर उपयोग करने के लिए लिपिड लोड किए गए THP-1 मैक्रोफेज से एक सरोगेट मैट्रिक्स कैसे उत्पन्न किया जाता है। इस केसम / सरोगेट बाध्यकारी परख तपेदिक दवा की खोज में एक महत्वपूर्ण उपकरण है और इसे अन्य रोगों के कारण घावों या फोड़े में दवा वितरण का अध्ययन करने में सहायता करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
फुफ्फुसीय तपेदिक रोग के उपचार के लिए विभिन्न प्रकार के घावों में दवाओं के प्रभावी वितरण की आवश्यकता होती है। नेक्रोटिक घावों और गुहाओं में कैसर के केंद्र होते हैं जो दवाओं के सहिष्णु या 'लगातार' बैक्टीरिया के उप-जनसंख्या को बंद कर देते हैं 1 , 2 सीवेटरी रोग न्यून उपचार दर और खराब रोग का निदान के साथ जुड़ा हुआ है। 3 , 4 पिछला अध्ययनों ने मात्रात्मक और इमेजिंग तकनीकों का उपयोग करते हुए दिखाया है, कि केस्यूम को घुसना करने की क्षमता एक दवा वर्ग से दूसरे में काफी भिन्न होती है। 5 , 6 हालांकि, इन विधियों को जानवरों के संक्रमण वाले मॉडल के उपयोग की आवश्यकता होती है जो धीमे और थकाऊ होते हैं एक इन विट्रो परख जो पूर्व विवो कैसुम के लिए बाध्यकारी दवाओं को तैयार किया गया था। यह बाध्यकारी पाया गया था कि मामले में ग्रेन्युलोमा में प्रवेश के साथ व्युत्क्रम संबंध है और, इसलिए, हैएक भविष्य कहनेवाला उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया 7
संतुलन डाइलाइसिस को प्लाज्मा प्रोटीन बाध्यकारी अध्ययनों के लिए स्वर्ण मानक दृष्टिकोण माना जाता है। तीव्र संतुलन डायलिसिस (आरईडी) डिवाइस ऐसे एशेज के लिए त्वरित, आसान उपयोग और विश्वसनीय प्रणाली प्रदान करता है। 8 डिवाइस दो घटकों से बना है: एकल-उपयोग, डिस्पोजेबल आवेषण जिसमें 2 कक्षों को अलग-अलग अर्ध-पारगम्य झिल्ली के ऊर्ध्वाधर सिलेंडर से अलग किया जाता है; और पुन: प्रयोज्य बेस प्लेट्स जो एक बार में 48 से सम्मिलित हो सकते हैं। डायलिसिस झिल्ली में 8 केडीए आणविक वजन कट ऑफ (एमडब्ल्यूसीओ) है जो दवा-मैक्रोमोलेकुले बाध्यकारी अध्ययनों के लिए आदर्श है। झिल्ली कम्पार्टमेंट का उच्च सतह क्षेत्र से मात्रा का अनुपात तेजी से डायलिसिस और संतुलन देता है। दोनों आवेषण और बेस प्लेट न्यूनतम गैर-विशिष्ट बंधन के लिए मान्य हैं। बायोएनालिटिकल तकनीकों के साथ लाल डिवाइस का संयोजन पी में दवाओं के अनबाउंड अंशों के सटीक अनुमान प्रदान करता हैLāsma। 8, 9
हालांकि मूल रूप से प्लाज्मा प्रोटीन बाध्यकारी को मापने के लिए बनाया गया है, लाल डिवाइस homogenates का उपयोग कर कई ऊतक बाध्यकारी अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है। 10, 11 इस प्रोटोकॉल में, हम पनीर, परिगलित मलबे परिगलित घावों और तपेदिक से संक्रमित खरगोशों की गुहाओं से अलग किया के लिए बाध्य दवा को मापने। किलाटी सामग्री के अकोशिकीय और गैर संवहनी प्रकृति यह आसान एक समरूप निलंबन कि परख के साथ संगत है में homogenize करने के लिए बनाता है।
यह देखते हुए कि पनीर के उत्पादन के लिए कठिन और मिलना मुश्किल है, प्रोटोकॉल भी एक सरोगेट मैट्रिक्स कि झागदार मैक्रोफेज से तैयार किया जाता है साथ प्रयोग के लिए मान्य किया गया है। THP-1 monocyte व्युत्पन्न मैक्रोफेज कई लिपिड निकायों कि उन्हें अपने 'झागदार' रूप को प्रदान कर जमा करने के लिए ओलिक एसिड के साथ प्रेरित कर रहे हैं। ये लिपिड लोड कोशिकाओं काटा जाता है औरएक मैट्रिक्स का निर्माण करने के लिए संसाधित किया गया है जिसे हम केससम के लिए एक किराए के रूप में उपयोग करते हैं। इस अध्ययन से पता चला है कि इस सरोगेट मैट्रिक्स के लिए बाध्यकारी औषधि केसियम के लिए बाध्यकारी के साथ अच्छी तरह से संबंध रखती है, प्रभावी रूप से विवो प्रक्रिया की नकल कर रही है जो ग्रेन्युलोमा और गुहों के कैसर कोर में दवा की रोकथाम को बाधित करती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
पल्मोनरी परिगलित घावों और तपेदिक से संक्रमित रोगियों में cavities बैक्टीरिया है कि नशीली दवाओं के उपचार के लिए अड़ियल हैं की उप-जनसंख्या होते हैं। इन संरचनाओं की किलाटी कोर एक बाह्य वातावरण में इन persisters को श?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम क्रमशः बेडकाक्लीन, पीए -824 (प्रीटीमनिड), एजेडी 5847, रेडेज़ोलिड और टेडिज़ोलिड प्रदान करने के लिए जॉनसन एंड जॉनसन, टीबी एलायंस, एस्ट्रा जेनेका, रिब-एक्स और ट्रूज़ थेरेपीटिक्स को धन्यवाद देना चाहते हैं। ब्रेंडन प्राइडोक्स, मैथ्यू ज़िमेर्मन, स्टीफन जुजुइन, एम्मा रे-जुराडो, नैन्सी रुएल, लीयन ली और डेनिएल वेनर ने मालाडी विश्लेषण, जैव-विश्लेषणात्मक विधियों, केसमोज किराए की तैयारी, रासायनिक संश्लेषण की तैयारी और खरगोश के केसम के अलगाव को समर्थन प्रदान किया। यह काम बिल और मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन से फंडिंग के साथ आयोजित किया गया, # ओपीपी 1044 9 66 और ओपीपी 10404050 वी। डार्टोईस, एनआईएच साझा इंस्ट्रुमेंटेशन ग्रांट एस 10OD018072, साथ ही विधेयक और मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन से संयुक्त धन और उत्कृष्टता केंद्र के लिए वेलकम ट्रस्ट विकासशील विश्व के रोगों के लिए पी। वायट के लिए लीड ऑप्टिमाइज़ेशन के लिए
Materials
| New Zealand White Rabbits | Covance | – | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
| THP-1 monocytic cell line | ATCC | ATCC TIB-202 | |
| 175cm² TC-Treated Flask (T175) | Fisher Scientific | T-3400-175 | |
| RPMI 1640 media w/o glutamine | Fisher Scientific | MT-15-040-CV | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated | Fisher Scientific | SH3091003IR | |
| Hyclone L-glutamine, 200mM | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| Cellstar TC dish, 145x20mm, vented | Fisher Scientific | T-2881-1 | |
| Phorbol 12-myristate13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685-1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Oleic acid | Fisher Scientific | ICN15178101 | |
| Pierce RED Device Reusable Base Plate | Fisher Scientific | PI-89811 | |
| Pierce RED Device Inserts, 50/box | Fisher Scientific | PI-89809 | |
| Pierce RED insert removal tool | Fisher Scientific | 89812 | |
| Adhesive plate seal | Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| PBS, pH7.4, 10 X 500 mL (Gibco) | Life Technologies | 10010-049 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | |
| Acetonitrile | Sigma | 34998 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma | V4629 | |
| Diclofenac sodium salt | Sigma | 93484 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15-250-061 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| 2010 Geno/Grinder | SPEX SamplePrep | 2010 | |
| Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads | Fisher Scientific | 15-340-158 | |
| 484R Cobalt 60 Irradiator | JL Shepard | 7810-484-1 | |
| INCYTO C-Chip Disposable Hemacytometers | Fisher Scientific | 22-600-100 | |
| Upright Light Microscope | Leica | DM1000 | |
| Binary Liquid Chromatography system | Agilent | 1260 | Multi-compenent |
| Mass spectrometer | AB Sciex | 4000 |
References
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