Her beskriver vi en hurtig-likevektsdialyse (RED) -metode for å måle legemiddelbindingen til kaseum fra lungekirberose-lesjoner og hulrom. Protokollen brukes også med en skummende makrofag-avledet matrise som er en effektiv surrogat til kaseum.
Utryddelsen av tuberkulose sykdom krever legemiddelregimer som kan trenge inn i de flere lagene av komplekse pulmonale lesjoner. Narkotikafordeling i tilfellehulene i hulrom og lesjoner er spesielt viktig fordi de har subpopulasjoner av stofftolerante bakterier, også ofte referert til som persister. Eksisterende metoder for måling av legemiddelinntrengning i tuberkulose-lesjoner medfører kostbare og tidkrevende farmakokinetiske studier in vivo koblet til bioanalytiske eller imagingteknikker. In vitro- måling av medikamentbinding til caseummakromolekyler ble foreslått som et alternativ til slike teknikker, siden denne binding hindrer passiv diffusjon av legemiddelmolekyler gjennom caseum. Hurtig likevektsdialyse er et raskt og pålitelig system for utførelse av plasmaprotein og vevsbindingsstudier. I denne protokollen brukte vi en hurtig-likevektsdialyse (RØD) enhet for å måle medikamentbindingen til homogenater av caseum som er excisUtført fra lesjoner og hulrom av tuberkuloseinfiserte kaniner. Protokollen beskriver også hvordan man genererer en surrogatmatrise fra lipidbelastede THP-1 makrofager for å bruke i stedet for caseum. Denne caseum / surrogatbindingsanalysen er et viktig verktøy for tuberkulose-legemiddelfunn og kan tilpasses for å bidra til å studere legemiddelfordeling i lesjoner eller abscesser forårsaket av andre sykdommer.
Behandlingen av pulmonell tuberkulose sykdom krever effektiv distribusjon av legemidler i forskjellige typer lesjoner. Nekrotiske lesjoner og hulrom inneholder caseous sentre som havner subpopulasjoner av stofftolerante eller "vedvarende" bakterier. 1 , 2 Kavitasykdommen er assosiert med dårligere herdesatser og dårlig prognose. 3 , 4 Tidligere studier har vist, ved hjelp av kvantitative og imaging teknikker, at evnen til å trenge inn i caseum varierer vesentlig fra en narkotikaklasse til en annen. 5 , 6 Disse metodene krever imidlertid bruk av dyreinfeksjonsmodeller som er treg og kjedelig. En in vitro- analyse som måler legemiddelbindende til eks vivo- caseum, ble designet. Denne binding ble funnet å reversere korrelere med medikamentpenetrering i caseous granulomer og er derforBrukes som et prediktivt verktøy. 7
Likevektsdialyse betraktes som gullstandardmetoden for plasmaproteinbindingsstudier. Den raske likevektsdialysen (RED) -enheten gir et raskt, brukervennlig og pålitelig system for å utføre slike analyser. 8 Enheten består av to komponenter: engangsbruk, engangsinnsatser bestående av 2 kamre adskilt av en vertikal sylinder av semi-permeabel membran; Og gjenbrukbare grunnplater som kan holde opptil 48 innlegg på en gang. Dialysemembranen har en 8 kDa molekylvekt cut-off (MWCO) som er ideell for medisin-makromolekylbindingsstudier. Det høye overflate-til-volumforholdet i membranrommet muliggjør rask dialyse og likevekt. Både innsatsene og basisplaten er validert for minimal, ikke-spesifikk binding. Kombinasjonen av den RØDE enheten med bioanalytiske teknikker gir nøyaktige estimater av ubundne fraksjoner av legemidler i plasma. 8 , 9
Selv om opprinnelig designet for å måle plasmaproteinbinding, har den RØDE enheten vært brukt i flere vevbindende studier ved bruk av homogenater. 10 , 11 I denne protokollen måler vi medikamentbindende til kaseum, den nekrotiske rusk skåret ut fra nekrotiske lesjoner og hulrom av tuberkuloseinfiserte kaniner. Den akellulære og ikke-vaskulære karakteren av caseous materiale gjør det enkelt å homogenisere til en homogen suspensjon som er kompatibel med analysen.
Gitt at caseum er kjedelig å produsere og vanskelig å komme forbi, har protokollen også blitt validert for bruk med en surrogatmatrise som er fremstilt fra skumete makrofager. THP-1 monocyt-avledede makrofager induseres med oljesyre for å akkumulere flere lipidlegemer som gir dem deres "skummende" utseende. Disse lipidbelagte cellene høstes ogBehandlet for å produsere en matrise som vi bruker som en surrogat til caseum. Denne studien har vist at medikamentbindingen til denne surrogatmatrisen korrelerer godt med binding til kaseum, som effektivt etterligner in vivo- prosessen som hindrer legemiddelpenetrasjon i caseous kjerne av granulomer og hulrom.
Pulmonale nekrotiske lesjoner og hulrom hos tuberkuloseinfiserte pasienter inneholder subpopulasjoner av bakterier som er motstridende for behandling av legemidler. Caseous kjerner av disse strukturer er spesielt ansvarlig for harboring disse persisters i et ekstracellulært miljø. 16 Gunstig fordeling av antibakterielle midler i disse avsidesliggende stedene antas å være en viktig determinant for tuberkulose narkotika effekt. Før valideringen av denne protokollen var det ingen tilgjengelige …
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å takke Johnson & Johnson, TB Alliance, Astra Zeneca, Rib-X og Trius Therapeutics for å gi bedaquiline, henholdsvis PA-824 (pretomanid), AZD5847, radezolid og tedizolid. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li og Danielle Weiner ga støtte med MALDI-analyse, bioanalytiske metoder, forberedelse av caseum surrogat, kjemisk syntese og isolering av kanin caseum. Dette arbeidet ble utført med finansiering fra Bill og Melinda Gates Foundation, pris # OPP1044966 og OPP1024050 til V. Dartois, NIH Felles Instrumentation Grant S10OD018072, samt felles finansiering fra Bill og Melinda Gates Foundation og Wellcome Trust for A Center of Excellence For blyoptimalisering for sykdommer i utviklingsverdenen til P. Wyatt.
New Zealand White Rabbits | Covance | – | |
HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
Ketathesia (Ketamine) 100mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
Anased (Xylazine) 100mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
THP-1 monocytic cell line | ATCC | ATCC TIB-202 | |
175cm² TC-Treated Flask (T175) | Fisher Scientific | T-3400-175 | |
RPMI 1640 media w/o glutamine | Fisher Scientific | MT-15-040-CV | |
Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated | Fisher Scientific | SH3091003IR | |
Hyclone L-glutamine, 200mM | Fisher Scientific | SH3003401 | |
Cellstar TC dish, 145x20mm, vented | Fisher Scientific | T-2881-1 | |
Phorbol 12-myristate13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685-1 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
Oleic acid | Fisher Scientific | ICN15178101 | |
Pierce RED Device Reusable Base Plate | Fisher Scientific | PI-89811 | |
Pierce RED Device Inserts, 50/box | Fisher Scientific | PI-89809 | |
Pierce RED insert removal tool | Fisher Scientific | 89812 | |
Adhesive plate seal | Fisher Scientific | 08-408-240 | |
PBS, pH7.4, 10 X 500 mL (Gibco) | Life Technologies | 10010-049 | |
DMSO | Sigma | 472301 | |
Acetonitrile | Sigma | 34998 | |
Methanol | Sigma | 34860 | |
Verapamil hydrochloride | Sigma | V4629 | |
Diclofenac sodium salt | Sigma | 93484 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15-250-061 | |
Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
2010 Geno/Grinder | SPEX SamplePrep | 2010 | |
Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads | Fisher Scientific | 15-340-158 | |
484R Cobalt 60 Irradiator | JL Shepard | 7810-484-1 | |
INCYTO C-Chip Disposable Hemacytometers | Fisher Scientific | 22-600-100 | |
Upright Light Microscope | Leica | DM1000 | |
Binary Liquid Chromatography system | Agilent | 1260 | Multi-compenent |
Mass spectrometer | AB Sciex | 4000 |