Presentiamo un metodo per quantificare la metilazione del DNA in base alla macchia dot-5-metilcitosina (5-mc). Abbiamo determinato i livelli di 5 mC durante la dedifferentiation dei condrociti. Questa semplice tecnica potrebbe essere utilizzata per determinare rapidamente il fenotipo condrocitico nel trattamento ACI.
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Articolo metodologico
Un test a blot di 5 mc quantificando il livello di metilazione del DNA della dedifferentiation di condrociti
In questo articolo
Sommario
Abstract
La dedifferentiation dei condrociti ialine nei condrociti fibroblastici spesso accompagna l'espansione monoselocca dei condrociti in vitro . Il livello globale di metilazione del DNA dei condrociti è considerato un biomarker adatto per la perdita del fenotipo condrocitico. Tuttavia, i risultati basati su metodi sperimentali diversi possono essere incoerenti. Pertanto, è importante stabilire un metodo preciso, semplice e rapido per quantificare i livelli globali di metilazione del DNA durante la dedifferentiation della condrociti.
Le tecniche di analisi di metilazione a livello genomico in gran parte dipendono dal sequenziamento genomico di bisolfito. A causa del degrado del DNA durante la conversione di bisolfito, questi metodi richiedono tipicamente un grande volume di campione. Altri metodi utilizzati per quantificare i livelli globali di metilazione del DNA includono la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC). Tuttavia, la HPLC richiede una completa digestione del DNA genomico. Inoltre, il costo proibitativamente elevato di HPLC inGli strumenti limitano l'applicazione più ampia di HPLC.
In questo studio, il DNA genomico (gDNA) è stato estratto da condrociti umani coltivati con un numero variabile di passaggi. Il livello di metilazione del gDNA è stato rilevato utilizzando un test di macchia puntale specifico per la metilazione. In questo approccio dot blot, una miscela di gDNA contenente il DNA metilato da rilevare è stata individuata direttamente su una membrana N + come punto all'interno di un modello di schema circolare precedentemente disegnato. Rispetto ad altri approcci di blotting a base di elettroforesi a base di gel e ad altre procedure di blotting complesse, il metodo dot blot consente di risparmiare tempo significativo. Inoltre, le macchie a punti possono rilevare il livello generale di metilazione del DNA utilizzando un anticorpo a 5 mc commercialmente disponibile. Abbiamo scoperto che il livello di metilazione del DNA differiva tra le sottoculture monolayer e quindi potrebbe svolgere un ruolo fondamentale nella dedifferentiation condrocitica. La macchia a punti da 5 mc è un metodo affidabile, semplice e rapido per rilevare il livello generale di metilazione del DNA da valutareE fenotipo condrocitico.
Introduzione
L'impianto di condrociti autologo (ACI) è una procedura relativamente nuova e all'avanguardia per curare i difetti della cartilagine articolare 1 , 2 . Uno dei punti cruciali in ACI è l'amplificazione dei condrociti attraverso la coltura monolayer in vitro . Durante l'amplificazione, i condrociti ialini facilmente perdono il loro fenotipo e diventano dedifferenziati, che è indesiderabile per il trattamento ACI 3 , 4 . Per ottimizzare l'esito del trattamento ACI, la dimensione della dedifferentiation dei condrociti dovrebbe....
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Protocollo
Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico Umano di Shenzhen Second People's Hospital.
1. Raccolta dei tessuti di cartilagine articolare umana e cultura condrocitica
- Preparazione dei materiali
- Preparare il mezzo modificato Dulbecco's medium di aquila (DMEM) integrato con 10% di siero fetale fetale e 1% di penicillina-streptomicina. Preparare 1 mg / mL collagenasi II, 0,25% trypsin-EDTA, salina fosfata-bufferata (PBS) e un filtro cellulare (40 μm nylon).
- Raccolta di tessuti articolari di cartilagine umana
- Isolare la cartilagine articolare dal....
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Risultati
I condrociti sono stati coltivati in un monostrato fino al passaggio 6 (P6). I condrociti hanno mostrato progressi fenotipici con passaggi successivi della coltura monolayer. La morfologia dei condrociti P0 era rotonda, mentre le cellule sono diventate altamente schiacciate e appiattite con passaggi successivi fino a P6 ( Figura 1 ). Questo cambiamento morfologico è tipico del processo di dedifferentiation condrocitico. Nel frattempo, i risultati della mappa termica ha.......
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Discussione
La dedifferentiation condrocitica in vitro compromette gravemente l'esito dell'ACI nel trattamento della riparazione di difetti della cartilagine 11 , 12 . Per ottimizzare l'esito ACI, è fondamentale evitare l'uso di condrociti dedifferenziati 13 . Gli studi hanno suggerito che il livello generale di metilazione del DNA è associato all'estensione della dedifferentiation condroscica 4
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalle seguenti sovvenzioni: Science Foundation of China (No. 81572198, No. 81260161, No. 81000460); Fondazione della Scienza Naturale della provincia di Guangdong, Cina (No. 2015A030313772); Progetto finanziato dalla Fondazione della scienza postduttorica cinese (n. 2013M530385); La Fondazione di ricerca medica della provincia di Guangdong, Cina (n. A2016314); Shenzhen Science and Technology Projects (No. JCYJ20160301111338144; No. JSGG20151030140325149; No. JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; No. JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagenti | |||
| DMEM | Gibco Inc. | 11965– 092 | Caldo a 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, privo di Ca2+/Mg2+ |
| FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
| 0,25% tripsina/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
| 1% Penicillina-Streptomicina | Gibco Inc. | 15140-122 | |
| Cloroformio | Mallinckrodt | 4440 | |
| Alcool isoamilico | Sigma | I-3643 | |
| Fenolo | Gibco BRL | 15513-039 | |
| Proteinasi K | Gibco BRL | 24568-2 | |
| TAE tampone | Bio Whittaker | 16-011V | |
| Acqua Distillata | Gibco BRL | 15230-170 | |
| 1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
| Tween20 | Biotopped Inc. | ||
| BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
| Collagenasi, Tipo II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
| Piatto Falcon 100 mm | Corning | 353003 | |
| Centrifuga Tube | TPP AG | 91050 | Centrifuga |
| ad alta velocità | gamma Eppendorf | 5804R | |
| ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
| Incubatore cellulare ad anidride carbonica | Thermo scientific | 3111 | |
| sistema di analisi per immagini chimiche | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |
Riferimenti
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).
- Pareek, A., et al. Long-Term Outcomes After Au....
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Ristampe e permessi
