5-mC Nokta-Blot Testi Kondrosit Farklılaşmasımın DNA Metilasyon Seviyesinin Nicelendirilmesi<em> In vitro</em
Summary
DNA metilasyonunu 5-metilsitozin (5-mC) nokta leke bazında ölçmek için bir yöntem sunuyoruz. Kondrosit farklılaşması sırasında 5-mC düzeylerini saptadık. Bu basit teknik ACI tedavisinde kondrosit fenotipini hızlı bir şekilde belirlemek için kullanılabilir.
Abstract
Hiyalin kondrositlerin fibroblastik kondrositlere ayrılması, genellikle in vitro olarak tek katlı kondrosit genişlemesine eşlik eder. Kondrositlerin küresel DNA metilasyon seviyesi, kondrosit fenotipinin kaybedilmesi için uygun bir biyolojik belirteç olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, farklı deneysel yöntemlere dayanan sonuçlar tutarsız olabilir. Bu nedenle, kondrosit farklılaşması sırasında küresel DNA metilasyon seviyelerini ölçmek için kesin, basit ve hızlı bir yöntem oluşturmak önemlidir.
Mevcut genom geniş metillendirme analiz teknikleri büyük oranda bisülfit genomik dizilemesine dayanmaktadır. Bisülfit dönüşümü sırasında DNA bozunumundan ötürü, bu yöntemler tipik olarak büyük bir numune hacmi gerektirir. Küresel DNA metilasyon seviyelerini ölçmek için kullanılan diğer yöntemler arasında, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) bulunur. Bununla birlikte, HPLC, genomik DNA'nın tam sindirimini gerektirir. Ek olarak, HPLC'nin yasakça yüksek maliyetiStrength, HPLC'nin daha geniş bir uygulama alanını sınırlar.
Bu çalışmada, genetik DNA (gDNA) çeşitli geçiş sayılarıyla kültürlenen insan kondrositlerinden ekstrakte edilmiştir. GDNA metilasyon seviyesi bir metilasyona özel dot blot testi kullanılarak tespit edildi. Bu dot blot yaklaşımında, tespit edilecek metile DNA'yı içeren bir gDNA karışımı, daha önce çizilmiş bir dairesel kalıp şablonunun içindeki bir nokta olarak bir N + membranına doğrudan lekelenmiştir. Diğer jel elektroforez esaslı lekelendirme yaklaşımları ve diğer kompleks lekelenme prosedürleri ile karşılaştırıldığında, nokta leke yöntemi önemli zaman kazandırır. Ayrıca, nokta lekeleri, piyasada bulunan bir 5-mC antikor kullanılarak genel DNA metilasyon seviyesini algılayabilir. DNA metilasyon seviyesinin tek katmanlı alt-kültürler arasında farklılaştığını ve bu nedenle kondrosit ayrımlaştıncılığında önemli bir rol oynayabileceğini bulduk. 5-mC nokta leke, genel DNA metilasyon seviyesinin değerlendirilmesi için güvenilir, basit ve hızlı bir yöntemdirKondrosit fenotipi.
Introduction
Otolog kondrosit implantasyonu (ACI), eklem kıkırdak defekti 1 , 2'yi tedavi etmek için nispeten yeni ve en gelişmiş yöntemdir. ACI'da önemli adımlardan biri , in vitro tek katlı kültür yoluyla kondrositlerin çoğaltılmasıdır. Yükseltme sırasında, hiyalin kondrositler fenotiplerini kolayca kaybederler ve difuzensiz hale gelirler; bu ACI tedavisi için istenmeyen 3 , 4'tür . ACI tedavisinin sonucunu optimize etmek için replantasyondan önce kondrosit farklılaşmasının derecesi belirlenmelidir. Kondrositlerin durumunu belirlemek için ekonomik ve hızlı bir yol oluşturmak zorunludur. Son zamanlarda, DNA metilasyonu ve kondrosit ayrımı ayırma arasındaki ilişki çok dikkat çekti 4 , 5 , 6 . DNA metilasyonu,Ich metil grupları DNA'ya ilave edilir ve sonuçta sitozin kalıntılarının 5-metilcytosine (5-mC) dönüştürülmesi sağlanır.
Kondrosit ayrımcılığında DNA metilasyon biyolojisini aydınlatmak için ilk adım şimdiye kadar zorlu olduğu kondrositlerin DNA metilasyon seviyesini değerlendirmektir. Bisülfit genomik sekanslama, DNA metilasyonunu analiz etmek için en yaygın kullanılan tekniktir 7 , 8 . Bu deneyde, bisülfit dönüşümü DNA bozunumuna neden olur ve bu nedenle tahlil için önemli miktarda numune sağlanmalıdır. Ayrıca, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) küresel DNA metilasyon seviyelerini 9 , 10'u ölçmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, HPLC analizi genomik DNA sindirimini gerektirir. Ayrıca ileri ve pahalı deneysel araçlar gereklidir. Bu nedenle, yüksek maliyetin yanı sıra, bu deneysel prosedürler zaman kazandırıcı niteliktedirharcanmasına neden olur. Anti-5-mC antikorlar, şimdi karmaşık genomlardan 5-mC içeren genomik DNA'nın bağışıklık lekelenmesi imkânı yaratan ticari olarak piyasaya sürülmüştür.
Bu raporda, bir dizi tek katmanlı kültür içinde yetiştirilen kondrositlerden genomik DNA çıkardık. İnsanlardaki kondrositlerdeki 5-mC içeriğini farklı sayıda pasajla değerlendirmek için bir nokta blot testi kullandık. Düşük ayrıştırılmış kondrositlerde, düşük dereceli ayrımcılığa sahip kondrositlere kıyasla 5-mC içeriğinin arttığını tespit ettik. Ayrıca, ayrımlaşma durumu ile 5-mC düzeyleri arasında bir ilişki olduğunu tespit ettik. Son olarak, 5-mC içeriğindeki değişikliklerin kondrosit fenotipi ile ilişkili olduğunu bildirdik. Bu nedenle, 5-mC nokta leke testi, kondrositlerdeki DNA metilasyon seviyesini tespit etmek için güvenilir, basit ve hızlı bir yöntemdir.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vitro kondrosit farklılaşması, kıkırdak defekti onarımı tedavisinde ACI sonuçlarını ciddi şekilde tehlikeye atar 11,12. ACI sonuçlarını optimize etmek için ayrılmamış kondrositlerin kullanılmasını önlemek çok önemlidir 13 . Çalışmalar, genel DNA metilasyon seviyesinin kondrosit dediferansiyasyonunun derecesi ile ilişkili olduğunu ileri sürdü4,6. Bu nedenle, klinik uygulamasından önce kondrositlerin genel DNA metilasyon durumunu saptamak için güvenili…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma aşağıdaki hibeler tarafından desteklenmiştir: Çin Doğa Bilimleri Vakfı (No. 81572198, No. 81260161, No. 81000460); Guangdong Eyaleti, Çin Doğal Bilimler Vakfı (No. 2015A030313772); Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı Finanse Projesi (No. 2013M530385); Çin'in Guangdong Eyaletindeki Tıbbi Araştırma Kurumu (No. A2016314); Shenzhen Bilim ve Teknoloji Projeleri (No. JCYJ20160301111338144; No. JSGG20151030140325149; No. JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; No. JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).
Materials
| Reagents | |||
| DMEM | Gibco Inc. | 11965–092 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline(PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, free of |
| Ca2+/Mg2+ | |||
| FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
| 0.25%Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
| 1%Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | |
| Chloroform | Mallinckrodt | 4440 | |
| Isoamyl Alcohol | Sigma | I-3643 | |
| Phenol | Gibco BRL | 15513-039 | |
| Proteinase K | Gibco BRL | 24568-2 | |
| TAE buffer | Bio Whittaker | 16-011V | |
| Distilled Water | Gibco BRL | 15230-170 | |
| 1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
| Tween20 | Biotopped Inc. | C58H114O26 | |
| BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
| Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Names | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment | |||
| Cell Strainer(40μm nylon） | FALCON Inc. | 352340 | |
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | |
| Centrifuge Tubes | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | |
| Chemi-imaging Analyse System | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |
References
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).
- Pareek, A., et al. Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years. Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).
- Duan, L., et al. Cytokine networking of chondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy. Am J Transl Res. 7 (2), 194-208 (2015).
- Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21 (4), 599-603 (2013).
- Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair. Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).
- Duan, L., et al. DNA methylation profiling in chondrocyte dedifferentiation in vitro. J Cell Physiol. , (2016).
- Bhat, S., et al. DNA methylation detection at single base resolution using targeted next generation bisulfite sequencing and cross validation using capillary sequencing. Gene. , (2016).
- Shi, X. W., et al. Exploring Genome-wide DNA Methylation Profiles Altered in Kashin-Beck Disease Using Infinium Human Methylation 450 Bead Chips. Biomed Environ Sci. 29 (7), 539-543 (2016).
- Li, X. L., et al. Optimization of an HPLC Method for Determining the Genomic Methylation Levels of Taxus Cells. J Chromatogr Sci. 54 (2), 200-205 (2016).
- Maghbooli, Z., et al. Global DNA methylation as a possible biomarker fordiabetic retinopathy. Diabetes Metab Res Rev. 31 (2), 183-189 (2015).
- Barlic, A., Drobnic, M., Malicev, E., Kregar-Velikonja, N. Quantitative analysis of gene expression in human articular chondrocytes assigned for autologous implantation. J Orthop Res. 26 (6), 847-853 (2008).
- Legendre, F., et al. Enhanced hyaline cartilage matrix synthesis in collagen sponge scaffolds by using siRNA to stabilizechondrocytes phenotype cultured with bone morphogenetic protein-2 under hypoxia. Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 550-567 (2013).
- Niethammer, T. R., et al. Analysis of the autologous chondrocyte quality of matrix-based autologous chondrocyte implantation in the knee joint. Int Orthop. 40 (1), 205-212 (2016).
- Hayatsu, H. The bisulfite genomic sequencing used in the analysis of epigenetic states, a technique in the emerging environmental genotoxicology research. Mutat Res. 659 (1-2), 77-82 (2008).
- Haque, N., Nishiguchi, M. Bisulfite sequencing for cytosine-methylation analysis in plants. Methods Mol Biol. 744, 187-197 (2011).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
