Vi beskriver bruken av en fenotypisk fluorescens-baserte neuraminidase inhiberingsanalyse for å vurdere i hvilken grad influensa A og B virus til neuraminidase inhibitor klasse av antivirale midler.
De neuraminidase (NA) inhibitorer er den eneste klassen av antivirale midler som er godkjent for behandling og profylakse av influensa som er effektive mot nåværende sirkulerende stammer. I tillegg til deres anvendelse ved behandling av sesong influensa, har de NA-inhibitorer lagre med en rekke land til bruk i tilfelle av en-epidemien. Det er derfor viktig å overvåke følsomheten av sirkulerende influensavirus til denne klassen av antivirale midler. Det finnes forskjellige typer av bestemmelser som kan brukes til å vurdere i hvilken grad influensavirus til NA-inhibitorer, men de enzyminhibering analyser ved anvendelse av enten et fluorescerende substrat eller en kjemiluminescent substrat er den mest brukte og anbefalt. Denne protokollen beskriver bruk av en fluorescens-basert assay for å bedømme influensavirus mottakelighet for NA-inhibitorer. Analysen er basert på NA enzymet spalte den 2 '- (4-metylumbelliferyl) -α-D-N -acetylneuraminic syre (Munana) Substrat for å frigjøre den fluorescerende produkt 4-metylumbelliferon (4-MU). Derfor er den inhiberende effekt av an NA-inhibitor på influensavirus NA bestemt basert på konsentrasjonen av NA inhibitor som er nødvendig for å redusere 50% av NA-aktivitet, gitt som en IC50-verdi.
Hemagglutinin (HA) og neuraminidase (NA) er de to hovedoverflate-glykoproteiner av influensa A og B virus. HA bindes til sialsyre-galaktose av celleoverflate-glykoproteiner eller glykolipider, mens den NA frigjør viruset ved spalting av sialinsyre fra galaktose på celleoverflaten 1. Na-inhibitorer er en klasse av influensaantivirale som ble rasjonalt designede å binde tett til NA enzymatiske aktive setet, for derved å hindre utslipp og spredning av virusavkom. Oseltamivir og zanamivir er to NA-hemmere som er godkjent i mange land over hele verden for behandling og forebygging av influensa. I de senere år, ytterligere to NA-hemmere, peramivir og laninamivir, er godkjent for bruk i et begrenset antall land. Screening av influensa vira til mottakelighet for NA-inhibitorer og identifikasjon av mutasjoner som medfører resistens er viktig ved bestemmelse og overvåking av effektivieness av denne klassen av antivirale midler.
I de siste 16 år, har den fluorescens-baserte NA inhiberingsanalyse blitt utført rutinemessig ved WHO Collaborating Centre for referanse og forskning på Influensa, Melbo (Urne WHOCCRRI) for å overvåke den endrede utviklingen av antivirale mottagelighet hos sirkulerende influensavirus. Årlig, er mer enn 2000 influensavirus testet for antiviral mottakelighet. I de fleste influensa årstider,> 98% av virus er følsomme for alle fire NA-inhibitorer 2, 3, 4, men i løpet av 2007 til 2008 nordlige halvkule influensa årstid, var det en økning i antallet av tidligere sesong A (H1N1) virus som hadde redusert følsomhet for oseltamivir 5. Denne gruppen av viruser, som inneholdt den NA aminosyresubstitusjon H275Y, spres til resten av verden ved utgangen av 2008. Den gjør oseltamivir inapproprispiste globalt for behandling av dette viruset. De aller fleste av tiden sirkulerer influensa B, influensa A (H3N2) og influensa A (H1N1) pdm09 stammer er utsatt for Oseltamivirs, selv om samfunnet klynger av A (H1N1) pdm09 varianter som inneholder NA aminosyresubstitusjonen H275Y som overfører redusert oseltamivir og peramivir mottakelighet, har blitt rapportert i ulike deler av verden 6, 7.
På grunn av behovet for et tilstrekkelig høyt virustiter, må kliniske prøver (inkludert dyr nesevasker) bli overført enten i cellekultur eller embryonerte kyllingegg før antiviral følsomhetstesting. NA-inhiberingsanalysen som er beskrevet i denne artikkelen, kan deles inn i tre deler:
Å bestemme det lineære område for den fluorescerende produkt 4-metylumbelliferon (4-MU) på et bestemt fluorometer
På grunn av de iboende forskjeller mellom fluorometers, than lineære område for den fluorescerende sluttproduktet, 4-MU, og den relative fluorescensen enheten (RFU), trenger å bli etablert. Når det lineære området for 4-MU er etablert, blir den optimale målsignalet valgt, til hvilken konsentrasjonen av influensavirus blir justert i den NA aktivitetsanalyse. Etter fullført for en bestemt fluorometer, bør dette ikke må gjentas.
Bestemmelse av NA aktiviteten av virusene
NA-aktivitetsanalyse er en enkel analyse som involverer tilsetningen av 2 '- (4-metylumbelliferyl) -α-D-N -acetylneuraminic syre (Munana) substrat til serielt fortynnet virus. Mengden av fluoriserende sluttprodukt 4-MU generert fra spaltingen av Munana ved NA blir målt ved anvendelse av et fluorometer. Den passende virus fortynning til bruk i den NA-inhiberingsanalyse er valgt ved å plotte fluorescensenheter mot virus fortynning. Fra sigmoidal kurve som produseres, bør midtpunktet av den lineære seksjon tilsvarer4-MU lineære området for fluorometer bestemt i seksjon 1 og vil informere den passende konsentrasjon av virus for å bli brukt i avsnitt 3.
Vurdering av virus mottakelighet for NA-inhibitorer ved hjelp av NA-inhiberingsanalysen
For å bestemme mottakeligheten til virus til et bestemt NA-inhibitor, er virus ved fortynning bestemt i seksjon 2 ble inkubert med et område av NA-inhibitorkonsentrasjoner. Etter en etterfølgende inkubering med Munana, er 4-MU generert av uinhiberte virus målt i RFU av fluorometeret. Den inhiberende effekt av NA-inhibitor på NA-enzymaktiviteten av et virus blir beregnet i henhold til NA-inhibitor-konsentrasjon som er nødvendig for å redusere 50% av NA-aktivitet, gitt som en IC50-verdi.
Den globale overvåkning av influensavirus mottakelighet for NA-inhibitorer er for tiden blir utført av en rekke laboratorier ved anvendelse av enten fluorescerende eller kjemiluminescerende NA inhiberingsanalysene 11, 12. Den fluorescens-undersøkelses er mer vanlig enn det kjemiluminescerende assay. Selv om begge analysene er robuste og reproduserbar, IC50-verdiene som ble oppnådd fra den fluorescens-baserte analysen er ofte høyere enn den kjemiluminescens-baserte analysen, noe som gjør en direkte sammenligning av data fra de to analysene vanskelige 13. Selv med bruk av den samme protokoll, kan data generert fra ett laboratorium variere fra en annen. På grunn av disse variasjoner mellom laboratorier, WHO-arbeidsgruppen for overvåkning av influensavirale Mottakelighet produsert en retningslinje for å bistå i inter-laboratorie sammenligninger. Snarere enn å sammenligne de absolutte IC50 verdier, denne retningslinjen bruks en sammenligning basert på IC-50 gangers forskjell til midt IC50 av NI influensavirus ble testet i hvert spesielt laboratorium. Evnen til å sammenlikne data fra de fem samarbeidende sentrene har resultert i den årlige publikasjon av global influensavirale følsomhetsdata 2, 3, 4. Tilgjengeligheten av den store mengden av influensa følsomhetsdata i den offentlige sfæren kan forskerne sammenligne IC 50 data fra disse studiene med det som genereres i egne laboratorier.
Andre NA inhiberingsanalysene som tar i bruk et lignende konsept er også kommersielt tilgjengelige. Disse kommersielle sett som inneholder klare til bruk reagenser (NA inhibitorene er ikke inkludert) er like reproduserbare. Imidlertid er in-house NA inhiberingsanalyse vesentlig billigere enn de kommersielle sett, fordi de fleste av de reagenser kan fremstilles in-house instørre mengder og Munana substratet, som tidligere utgjorde det store kostnadene av analysen, kan nå kjøpes fra forskjellige kilder, til konkurransedyktige priser. Kostnaden for å teste ett isolat influensa per stoffet er omtrent $ 1 (USD). På Melbourne WHOCCRRI, er det gjort forbedringer for in-house NA inhiberingsanalyse etter innlemmelse av en robot-plattform for væskehåndtering komponenter av analysen. Bortsett fra manuell fremstilling av virus fortynninger, er de fleste av operasjonene som utføres ved hjelp av væskehåndteringsrobot. Ikke bare gjør dette redusere manuell håndtering, men det øker også antall analyser som kan kjøres på en dag.
Selv om NA-inhiberingsanalysen er meget robust, finnes det en rekke viktige tiltak som må fylles ut med ekstra omhu. Først enhver uregelmessighet i de NA inhibitorkonsentrasjoner kan forskyve inhiberingskurvene og IC50-verdier; Derfor bør forsiktig oppmerksomhet værebetalt ved utarbeidelsen av NA inhibitorkonsentrasjoner. For det andre, nøyaktig pipettering og nøyaktig inkubasjonsperioder er avgjørende for å opprettholde konsistente resultater på tvers av analyser; Dette kan oppnås ved anvendelse av kalibrerte pipetter og tidsur. Inkluderingen av kontrollvirus i hver analyse muliggjør også overvåking av målemetoden fra analyse for å analysere og over lange tidsperioder. For det tredje, fordi den NA enzymaktiviteten av sesong influensavirus er optimal ved pH 6,5, er den riktige pH-verdien i analysebuffer viktig. Enkelte rapporter har funnet at anvendelse av lavere pH-forhold kan forbedres identifisering av influensa varianter, slik som A (H7N9)-variant inneholdende mutasjon R292K 14, 15. Imidlertid vil endring av pH-verdien i analysebuffer forskyve IC50-verdier, og dette kan komplisere sammenligningen av data i laboratorier og mellom laboratorier. Andre modifikasjoner og feilsøking som kan være performed er oppført i tabell 5.
Na-inhibitorer er den eneste klassen av godkjente antivirale midler som for tiden er effektive mot sirkulerer influensavirus. Inntil andre antivirale klasser blitt tilgjengelige for klinisk bruk, vil den antivirale mottakelighet overvåking av sirkulerende influensavirus være fokusert på NA-inhibitorer alene. På grunn av enkelheten og reproduserbarheten av resultatene, til bruk av NA-inhiberingsanalysen vurdere influensavirus mottakelighet for NA-inhibitorer vil fortsette.
The authors have nothing to disclose.
Melbourne WHO samarbeidssenter for Referanse og forsknings Influensa er støttet av den australske regjeringen Department of Health.
Influenza A and B viruses | Cultured in MDCK cells or 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) eggs | ||
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | PTA-6500 | |
2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) | Biosynth AG | M-5507 | |
2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) | Sigma | M8639 | |
4-Methylumbelliferone (4-MU) | Sigma | M1381-25G | |
2-[N-morpholino]ethanesulphonic acid (MES hydrate) (free acid) | Sigma | M8250-250G | |
Calcium Chloride (Ca Cl2) | APS AJAX Finechem | 127-500G | |
Surfactant-Amps-NP-40 (10% solution) | Thermo Fisher Scientific | PIE28324 | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | APS AJAX Finechem | 482-2.5KG | |
Absolute Ethanol | APS AJAX Finechem | 214-2.5L GL | |
96-well clear flat-bottom plates | NUNC | 456537 | |
96-well U-bottom plates | Greiner Bio-one | 4650101 | |
8 channel deep well block | Pacific Laboratory Products | RES-MW8-HP | |
96-well deep plates, 2.0mL square wells | Pacific Laboratory Products | P-2ML-SQ-C | |
Plate sealers | Thermo Fisher Scientific | 236366 | |
Bottle-top vacuum filter system (cellulose membrane (nitrate), pore size 0.2 μm, membrane area 33.2 cm2, filter capacity 500 mL) | Sigma-Aldrich | CLS430758-12EA | |
Single-channel pipettes (1 µL – 1000 µL) | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | ||
Multi-channel pipettes | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | 8 or 12 channel electronic and manual pipette (5 – 1250 µL volume) | |
Pipette tips (1 µL – 1250 µL) | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | ||
Disposable pipettes (10 mL and 25 mL) | Greiner Bio-one | P7740-200EA and P7865-200EA | |
Pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | |
Centrifuge tubes 50 mL | BD Bioscience | 352070 | |
Racked tubes | Scientific Specialties, Inc. | 1750-00 | |
Fluorometer with excitation wavelength setting of 355 nm and an emission wavelength setting of 460 nm | TermoFisher Scientific | ASCENT FL 374 | |
Ascent software | TermoFisher Scientific | 5185410CD | |
Incubator set at 37°C | Lab Supply | Biocell 1000 | |
Zanamivir | GlaxoSmithKline | Request directly from the company | |
Oseltamivir carboxylate | Roche | ||
Peramivir (BCX-1812) | BioCryst | ||
Laninamivir (R-125489) | Daiichi-Sankyo | ||
JASPR v1.2 | Influenza Division at the CDC Atlanta, USA | freely available upon request (fluantiviral@cdc.gov) |