神経成長因子カプセル化のための新規HDL模倣ナノ粒子の調製とキャラクタリゼーション
Summary
単純なホモジナイゼーションを用いて、神経成長因子を封入するための新規な高密度リポタンパク質模倣ナノ粒子を調製した。課題、ナノ粒子の調製、 インビトロの特性評価、およびインビボ研究の詳細なプロトコールがこの記事で説明されています。
Abstract
この記事の目的は、神経成長因子（NGF）負荷、高密度、リポタンパク質（HDL）模倣性ナノ粒子（NP）の調製および特徴付け方法を紹介することである。 HDLは内因性NPであり、治療剤の送達のための媒体として研究されている。 HDL模倣NPを調製するための様々な方法が開発されている。しかしながら、それらは一般に複雑で時間がかかり、工業規模では困難である。この研究では、一段階ホモジナイゼーションを用いて賦形剤を混合し、プロトタイプNPを形成した。 NGFは26kDaの水溶性タンパク質である。 HDL模倣NPの脂質環境へのNGFの封入を容易にするために、プロタミンUSPを用いてNGFとイオン対複合体を形成し、NGF表面の電荷を中和した。次いで、NGF /プロタミン複合体をプロトタイプNPに導入した。アポリポタンパク質AIを最終的にNPの表面上に被覆した。 NGF HDL模倣NPは、長期間に好ましい特性を示した粒度分布、捕捉効率、 インビトロ放出、生物活性、および生体内分布が含まれる。 HDL模倣NPにおけるホモジナイゼーションの注意深い設計と探索により、手順は大幅に単純化され、NPはスケーラブルに作られました。さらに、NPから無負荷NGFを分離し、 in vitro放出試験を確実に行い、NPの生物活性を測定するなどの様々な課題が克服された。
Introduction
タンパク質、ペプチド、および核酸などの高分子は有望な投薬として出現しており、過去数十年間でかなりの注目を集めています1,2 。彼らの高い有効性と特定の行動様式のために、彼らは癌、免疫疾患、HIV、および関連する病気の治療のための大きな治療可能性を示す3,4。しかしながら、それらの大きな分子サイズ、三次元構造、表面電荷、および親水性のような物理化学的性質は、これらの高分子のin vivo送達を非常に困難にする。これは彼らの臨床的使用を著しく妨げる4 。マイクロ粒子、ポリマーナノ粒子（NP）、リポソーム、および脂質NPなどの薬物送達システムにおける最近の進歩は、これらの課題を克服し、巨大分子のin vivo送達を有意に改善した。ホこれらの送達貨物に関するいくつかの欠点が明らかにされており、薬物負荷能力が低く、捕捉効率が低く、半減期が短く、生物活性が低下し、望ましくない副作用があることが明らかにされている5,6,7,8。有効なキャリアシステムは依然として研究の関心領域である。さらに、薬物を含むNPを特徴付ける分析方法の開発は、小分子よりも巨大分子にとってより困難である。
高密度リポタンパク質（HDL）は、アポリポタンパク質およびリン脂質単分子膜で被覆された脂質コアからなる天然NPである。内在性HDLは、SR-BI、ABCAI、およびABCG1などの標的受容体とのその相互作用を介して、脂質、タンパク質および核酸の輸送において重要な役割を果たす。それは、異なる治療剤の送達のための媒体として探求されている9、 10,11,12 。 HDL模倣NPを調製するための様々な方法が開発されている。透析は一般的なアプローチです。この方法において、NPは、コール酸ナトリウム溶液を用いて脂質膜を水和させることによって形成される。次に、塩を3つの緩衝液で2日間透析することにより除去する（ 13） 。超音波処理法は、加熱条件下で脂質混合物を60分間超音波処理することによりNPを製造する。 NPはゲルクロマトグラフィーによりさらに精製される14 。マイクロフルイディクスは、マイクロ流体デバイスを介してNPを生成し、マイクロ流体デバイスは、リン脂質およびアポリポタンパク質AI（Apo AI）溶液を、集束パターンで微小渦を生成することによって混合する。明らかに、これらの方法は、工業規模でのスケールアップには時間がかかり、厳しく、困難な場合があります。
この記事では、神経のための新規なHDL模倣NPの調製および特徴付けを紹介する成長因子（NGF）カプセル化。 NGFは、2つの13.6kDaポリペプチドモノマーを含むジスルフィド結合ポリペプチドホモダイマーである。ホモジナイゼーションによってNPを調製し、続いてNGFをNPにカプセル化する新規手順を開発した。 NGF HDL模倣NPは、粒子サイズ、サイズ分布、ゼータ電位、およびインビトロ放出に関して特徴付けられた 。それらの生物活性を、PC12細胞における神経突起伸長について評価した。マウスの静脈内注射後のNGF HDL模倣NPの体内分布を遊離NGFの体内分布と比較した。
Protocol
Representative Results
Discussion
この研究では、NGFカプセル化のためにHDL模倣NPを調製する簡単な方法を実証する。様々なNP送達系がタンパク質を送達するために研究されている。現在、多くのNP調製物は、透析、溶媒沈殿、および膜水和を含む。これらのプロセスは一般に複雑であり、スケールアップには困難が伴う。このNP発達の間、脂質は容器のガラス壁に強い接着性を有し、薄膜を水和させ、賦形剤を効率的に混?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、Dong、X.に対するNIH R03 NS087322-01によって支持された。
Materials
| Recombinant Human Beta-NGF | Creative Biomart | NGF-05H | |
| L-a-Phosphatidylcholine (PC) | Avanti | 131601P | 95%, Egg, Chicken |
| Sphingomyelin (SM) | Avanti | 860062P | Brain, Porcine |
| Phosphatidylserine (PS) | Avanti | 840032P | Brain, Porcine |
| Cholesteryl oleate (CO) | Sigma | C9253 | |
| D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS) | BASF | 9002-96-4 | Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | meets USP testing specifications |
| Apolipoprotein A1, Human plasma | Athens Research & Technology | 16-16-120101 | 1mg in 671 µl 10 mM NH4HCO3, pH 7.4 |
| Sepharose 4B-CL | Sigma | CL4B200 | Cross-linked agarose, gel filtration chromatography column filling material |
| Sandwich ELISA Kit for NGF | R&D system | DY008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| RPMI-1640 medium | GE Healthcare Life Science | SH30096.02 | |
| Horse serum | GE Healthcare Life Science | SH30074.03 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10082147 | |
| PC12 cells | ATCC | CRL-1721 | |
| Rat tail collagen type I | Sigma | C3867 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31414 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Benzethonium chloride | Sigma | B8879 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Homogenizer | Tekmar | T 25-S1 | |
| Delsa Nano HC particle analyzer | Beckman-Coulter | Delsa Nano HC | |
| Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device | Spectrum Laboratories | G235036 | Molecule Cutoff 300 kDa |
| Centrifuge | Eppendoff | 5424R | |
| Polytron homogenizer | Kinematica | PT 1200C | |
| DecapiCone | Braintree Scientific Inc. | DC-M200 |
References
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