Elektrofysiologisk karakterisering af kardiomyocytter afledt af humane pluripotente stamceller (hPSC-CM'er) er afgørende for hjertesygdomsmodellering og til bestemmelse af lægemiddelresponser. Denne protokol tilvejebringer de nødvendige oplysninger til at dissociere og plader hPSC-CM'er på multi-elektrode arrays, måle deres feltpotentiale og en metode til analyse af QT- og RR-intervaller.
Kardiomyocytter kan nu udledes med høj effektivitet fra både humane embryonale og humane inducerede-pluripotente stamceller (hPSC). HPSC-afledte cardiomyocytter (hPSC-CM'er) anerkendes i stigende grad som værende af stor værdi for modellering af kardiovaskulære sygdomme hos mennesker, især arytmi-syndromer. De har også vist relevans som in vitro- systemer til forudsigelse af lægemiddelresponser, hvilket gør dem potentielt nyttige til narkotika-screening og -opdagelse, sikkerhedsfarmakologi og måske til sidst for personlig medicin. Dette ville blive lettere ved at udlede hPSC-CM'er fra patienter eller modtagelige individer som hiPSC'er. For alle anvendelser er præcis måling og analyse af hPSC-CM elektriske egenskaber imidlertid afgørende for at identificere ændringer som følge af hjerte ionkanalmutationer og / eller lægemidler, der målretter ionkanaler og kan forårsage pludselig hjertedød. Sammenlignet med manuel patch-klemme, giver multi-electrode array (MEA) enheder fordelene vedTillader optagelse af mellem- til høj gennemløb. Denne protokol beskriver, hvordan man dissocierer 2D cellekulturer af hPSC-CM'er til små aggregater og enkeltceller og plader dem på MEA for at registrere deres spontane elektriske aktivitet som feltpotentiale. Metoder til analyse af de registrerede data til ekstraktion af specifikke parametre, såsom QT og RR intervallerne, er også beskrevet her. Ændringer i disse parametre ville forventes i hPSC-CM'er, der bærer mutationer, der er ansvarlige for hjertearytmi og efterfølgende tilsætning af specifikke lægemidler, hvilket tillader detektion af dem, der bærer en kardiotoksisk risiko.
Human Pluripotent Stamceller (hPSC'er) har evnen til selvfornyelse og genererer stort set enhver celletype af menneskekroppen gennem differentiering 1 , 2 . Detaljerede protokoller om, hvordan man differentierer hPSC'er til flere hjertestamninger (ventrikulære, atriale, pacemakerlignende kardiomyocytter) er blevet beskrevet 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Kardiomyocytter er elektrisk aktive celler, og detaljeret viden om deres elektrofysiologiske aktivitet kan være yderst informativ til forståelse af hjerteudvikling og sygdom 8 . Patientspecifikke hiPSC-afledte cardiomyocytter (hiPSC-CM'er) har med succes været anvendt til at modelere og studere de cellulære, molekylære og elektriske egenskaber ved flere hjertearytmier, herunder Long QT Syndrome(LQTS) 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , Brugada syndrom 14 og kathecolaminerge polymorfe ventrikulære takykardier 15 , 16 . Endvidere er flere lægemidler blevet tilsat til syge hiPSC-CM'er for at rekapitulere terapeutisk indgreb og for at redde de cellulære patologiske fænotyper 10 , 15 , 20 , 21 , 22 . For nylig er screeningsplatforme baseret på WT hiPSC-CM'er udviklet som reaktion på behovet for humane systemer til de tidlige faser af lægemiddelopdagelse 23 , 24 , 25, da gnaverkardiomyocytter varierer dybt fra huMans i ionkanalekspression og biofysik 26 .
Til dette formål udvikles og implementeres teknologier, der er egnet til medium til høj gennemstrømning. Disse omfatter optiske optagelser af membranpotentiale, Ca 2+ transienter og belastning, impedansmålinger (som en indirekte måling af cellekontraktilitet) og ekstracellulære feltpotentiale (FP) målinger (for gennemgang se ref. 24 ). Multi-electrode Arrays (MEA) enheder tillader optagelse af de elektriske bølgeformsignaler (eller FP'er) der genereres og formes af monolag eller små klynger af cardiomyocytter. FP-konturen korrelerer med det kardiale virkningspotentiale og til en vis grad med elektrokardiogramoptagelserne 27 ; De viser typisk en indledende hurtig opstrækning svarende til Na + tilstrømning og membran depolarisering (R / Q peak), en langsom bølge / plateau fase sandsynligvis svarende til Ca2 + tilstrømning og en repolarisationsfase svarende til en overvejende K + udstrømning (T peak). FTP-bølgeformens forstyrrelse kan korreleres med ændringer i specifikke aktionspotentielle faser 28 .
Selvom patch clamp-optagelser af aktionspotentialer kunne være mere informative, især for parametre som opstødshastighed og hvilemembranpotentiale, er manuelle målinger ikke mulige til eksperimenter ved mellem- og høj gennemstrømningsskala, mens automatiseret patch klemme først er blevet anvendt til hPSC -CMs 29 . Da langvarige optagelser på MEA tillader både akut og kronisk eksponering for forbindelser, der skal undersøges, er det nu muligt at anvende hPSC-CM-platforme til lægemiddel screening, opdagelse 24 , 30 og for sikkerhedsfarmakologi 31 , 32 . Dette holder løftet om fremtidig præcision eller persoNaliseret medicin 33 .
Formålet med denne protokol er at tilvejebringe de nødvendige oplysninger til dissociating og plating af hPSC-CM'er på MEA-chips og måling af deres FP. I denne procedure er hvert trin optimeret, hvilket sikrer optimal celleoverlevelse og genopretning efter dissociation, optimal cellehæftning til MEA-pladen og standardiseret analyse og kvantificering af parametre. Specielt forklares og eksemplificeres proceduren for ekstracellulær FP-registrering, analyse af QT- og RR-intervaller og evaluering af lægemiddelvirkninger.
Denne protokol viser, hvordan man dissocierer og forbereder hPSC-CM'er til måling af deres FP ved hjælp af MEA'er. HPSC-CM'er viser sædvanligvis spontan elektrisk aktivitet, som kan måles som FP og kan give meningsfulde data med hensyn til slagfrekvens, QT-intervalvarighed og arytmiske hændelser.
Dissociering af 2D-hjerte-differentierede kulturer er nødvendig for at genskabe et slaglag på MEA, og det repræsenterer et kritisk trin. Mekanisk stress ved gentagen pipettering og / eller aggressiv dissociation enzymbehandling kan resultere i høj celledødelighed, manglende vedhæftning til MEA-pladen og mangel på spontan elektrisk aktivitet. Denne protokol er blevet optimeret til monolagskulturer. Imidlertid kan en lignende fremgangsmåde anvendes til tredimensionale (3D) kulturer ( fx embryoidlegemer eller EB'er) med mindre modifikationer, såsom indsamling af EB'er efterfulgt af PBS-vask og længere inkubationstid med dissocierende enzym. ImportereAntly, i både 2D og 3D differentierede kulturer, kunne de ældre de differentierede celler, den længere inkubationstid, der kræves, være at frigøre cellerne på grund af forøget ekstracellulær matrixaflejring.
Protokollen beskrevet her for kvantificering af FP parametre kan anvendes til at generere dosis-respons kurver for cardioaktive lægemidler. Som for nylig beskrevet af Cavero et al. 31 , kan udgangskoncentrationen af et lægemiddel dybt påvirke resultatet af en MEA-måling. Derfor foreslår vi følgende for at forbedre nøjagtigheden og pålideligheden af resultaterne: 1) i tilfælde af irreversible aktivatorer / blokkere, brug relativt store volumener medium indeholdende det lægemiddel, der skal testes. Fjern mere detaljeret 10-50% af mellemvolumenet fra MEA-chippen og tilsæt et lige stort antal medier, hvor stoffet tidligere var opløst ved den passende koncentration. I dette tilfælde er det afgørende for at beregne den endelige lægemiddelkoncentrationEr ændringen i koncentration efter medium fjernelse. 2) I tilfælde af reversible aktivatorer / blokkere tilsættes 10 μL af hver lægemiddeldosis fra en 100X stamopløsning.
Størstedelen af de kardiale differentieringsprotokoller resulterer i en variabel blandet population af nodallignende, atriumlignende og ventrikulære lignende kardiomyocytter, hvor ventrikulærtypen er den mest repræsenterede. Dette kan udgøre en begrænsning ved modellering af hjertesygdomme, som påvirker en specifik kardiomyocyt-subtype eller lægemidler, der virker på hjerte-subtypespecifikke ionkanaler. Selvom flere undersøgelser har optimeret betingelser for at styre mere kontrolleret specifikation under hjertedifferentiering 3 , 5 , 37 , 38 , er deres bredere anvendelighed stadig under undersøgelse.
Endvidere varierer effektiviteten af differentiering (i forskellige forsøg og i diFferent hPSC linjer) kan observeres 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44 . Kardiomyocytberigende strategier baseret på overfladeproteinekspression 35 , 45 (ved hjælp af florescensassisteret cellesortering eller ved magnetisk beadsudvælgelse 46 , 47 ) og metabolisk udvælgelse 44 , 48 kan repræsentere gyldige strategier, som kan anvendes til enhver (genetisk modificeret eller Umodificeret) hPSC-line forudgående plating af hPSC-CM'erne for at forbedre det elektriske signal.
Selvom hPSC-CM'er er notorisk umodne sammenlignet med humane voksne cardiomyocytter 4 , 49 , har de vist sig at være værdifulde i rEcapitulering og identifikation af specifikke sygdomsrelaterede ændringer ( f.eks . I kanalopati) 19 , 20 , 50 og lægemiddelinducerede responser ( fx hjerte ionkanalblokkere) 4 , 51 . Endvidere er umodne celler lettere at dissociere og genvinde bedre end voksne kardiomyocytter efter dissociation og plating 44 Derfor kan hPSC-CM umodenhed belønnes som en fordel i denne henseende. Men for at kunne rekapitulere f.eks . Sygdomme med forsinket hjertesygdomme og trofast reproducere lægemiddelresponser af voksne kardiomyocytter, bør der opnås en mere moden mekanisk, metabolisk og elektrisk hPSC-CM-tilstand. Metoder til at modne disse celler indbefatter langvarig tid i kultur 52 , mekanisk stamme 53 , elektrisk stimulering 54 , tilsætning af småMolekyler 55 , 3D-kultur 56 , samkultur med andre celletyper 57 og endog en kombination af disse fremgangsmåder 58 ; Hidtil har ingen af disse tilgange ført til en voksenlignende fænotype.
Som en del af ufuldstændighedsegenskaberne viser hPSC-CM'er elektrisk automatik. Her gives der detaljer om, hvordan man præcist kvantificerer QT og RR intervaller. En begrænsning af måling af spontan elektrisk aktivitet er, at sammenligning af QT-intervaller kan være vanskelig, når hPSC-CM'er udviser forskellige slagfrekvenser. I dette tilfælde kan Bazett eller Fridericia's formler bruges til at korrigere QT-intervallet for frekvensen. Som tidligere rapporteret 30 anbefaler vi dog stærkt at udføre Major-Axis regressionsanalyse ved at udforme QT interval versus RR interval for både rå og korrigeret data for at udelukke enhver mulig forspænding som følge af selve korrektionsmetoden.
Protokollen, der præsenteres her sammen med tidligere beskrevne fremgangsmåder 59 , 60 hjælper standardiseringen af procedurerne og analysen af hPSC-CM FP'er, forbedrer data reproducerbarhed og muliggør en bedre sammenligning af interlaboratorieresultater.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af følgende stipendier: CVON (HUSTCARE): Det Hollandske Hjertestiftelsesforbund (Holländsk Hjertestiftelse, Hollænderforbundet for Universitetsmedicinske Centre, Den Hollandske Organisation for Sundhedsforskning og Udvikling og Det Kongelige Videnskabsakademi) Det Europæiske Forskningsråd (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC). Vi takker E. Giacomelli (LUMC) for hjælp med hPSC hjerte differentiering.
Biological safety cabinet/laminar flow hood | Cleanair | ||
MEA2100 in vitro recording system | Multi Channel Systems | ||
CO2 cell culture incubator | Sanyo | MCO-15A | |
Centrifuge | Hitachi | himac-CT6EL | |
Leica stereomicroscope | Leica Microsystems | MS5 | |
Handheld pipetman (P-10 (10μL), P-200 (200μL), P-1000 (1000μL)) | Gilson International | ||
Filter tips (10 μL, 200μL, 1000μL) | Corning | 4807 (10 μL), 4810 (200μL), 4809 (1000μL) | |
Disposable bottle top filter (0.22 μm pore size) | Millipore | SCGVU02RE | |
Sterile plastic pipette | Greiner Bio-One | 606180 (5 mL), 607180 (10 mL), 760180 (25 mL) | |
Tweezers | Dumont | ||
Autoclavable Petri dishes | VWR/ Duran Group | 391-0860 | |
MEA chip | Multi Channel Systems | MEA200/30iR-Ti-gr | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14040-091 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-169 | |
Human recombinant fibronectin | Tebu-Bio | J64560 | |
Custom made polytetrafluoroethylene (PTFE) MEA rings | LUMC: department of Instrument Development | ||
Dissociation enzyme – TrypLE Select 1X | Thermo Fisher Scientific | 12563-029 | |
Tergazyme enzyme detergent | Sigma-Aldrich | Z273287-1EA | |
Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230-089 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents for LI-BPEL medium | |||
IMDM | Thermo Fisher Scientific | 21056-023 | |
F12 | Thermo Fisher Scientific | 31765-027 | |
Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-038 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070-063 | |
Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
Protein Free Hybridoma Medium-II (PFHMII) | Thermo Fisher Scientific | 12040-077 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Bovogen Biologicals Australia | BSAS05 | |
Poly(vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
Chemically Defined Lipid Concentrate (CDLC) | Thermo Fisher Scientific | 11905-031 | |
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS-X) 100X | Thermo Fisher Scientific | 51599-056 | |
α-Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
Name | Company | Software version | Comments |
MC_Rack | Multi Channel Systems | 4.6.2 | Alternatively, data can be recorded using Cardio2D or MC_Experimenter (MultiChannel Systems) |
TCX Control | Multi Channel Systems | 1.3.4 | |
MEA Select | Multi Channel Systems | 1.3.0 | |
MC_Data Tool | Multi Channel Systems | 2.6.15 | Alternatively, Multi Channel Data Manager (MultiChannel Systems) can be used when custom data export is required (HDF5, EDF, etc.) |
Clampfit | Molecular Devices | 7.0.0 | Used in step 10.1 for analyzing, graphing, and formatting of all of data. To use Clampfit, download and install the electrophysiology data acquisition and pClam (latest version, 10.7.0), available on the Molecular Devices Website. Once complete, launch the software Clampfit. Alternatively, data can be analysed using Cardio2D (MultiChannel Systems) or MatLab custom code. |