चार-रंग के प्रतिदीप्ति प्रतिरक्षकों में टी-सेल उप-जनसांख्यिकीय अभिलेखीय फॉर्मलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड मानव ऑरोफरीन्गल स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा नमूने
Summary
ट्यूमर माइक्रोएन्नेरमेंट में प्रतिदीप्ति प्रतिरक्षा सेल आबादी के नंबर, रिश्तेदार वितरण और स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए मल्टीपार्मेटर प्रतिदीप्ति इम्यूनोहिस्टोकेमेस्ट्री का उपयोग किया जा सकता है। यह पांडुलिपि ऑओरोफेरीन्जियल कैंसर में टी-सेल उप-जनसंपर्क का विश्लेषण करने के लिए इस तकनीक के उपयोग का वर्णन करता है।
Abstract
चार-रंग की प्रतिदीप्ति इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) तकनीक एक ऐसी विधि है जो रुचि के सेल आबादी को मापने के तरीकों को अपने रिश्तेदार वितरण और ऊतक में उनके स्थानीयकरण को ध्यान में रखते हुए। इस तकनीक को विभिन्न ट्यूमर प्रकारों में प्रतिरक्षा घुसपैठ का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से लागू किया गया है। ट्यूमर माइक्रोएनेरमेंट प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा घुसपैठ की जाती है जो ट्यूमर साइट से आकर्षित होते हैं। विभिन्न प्रतिरक्षा सेल आबादी ट्यूमर माइक्रोएनेरमेंट में विभिन्न भूमिकाएं निभाने और रोग के नतीजे पर एक अलग प्रभाव पाने के लिए पाए गए हैं। यह पांडुलिपि एक उदाहरण के रूप में ओरोफरीन्गल स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (ओपीएससीसी) पर मल्टीपरैमेटर फ्लोरोसेंस आईएचसी के उपयोग का वर्णन करता है। इस तकनीक को अन्य ऊतक नमूनों और सेल प्रकार के ब्याज के लिए बढ़ाया जा सकता है। प्रस्तुत अध्ययन में, हमने एक बड़े ओपीएससी काउहर्ट (एन = 162) के इंटरेपिटेलियल और स्ट्रॉम्मल डिब्बे का विश्लेषण किया। हम कुल टी लिम्फोसाइटों (सीडी 3 + ), इम्युनोस्पॉस्प्रेज़ विनियमन पर केंद्रित थेस्ट्रॉमा से ट्यूमर एपिथेलियम को अलग करने के लिए परमाणु काउंटरस्टेन का इस्तेमाल करते हुए ओरी टी कोशिकाएं (टीग्स; यानी, फॉक्स पी 3 + ), और टी हेल्पर 17 (ते 17) कोशिकाओं ( यानी, आईएल -17 + सीडी 3 + ) इंट्राटमोलॉलिक आईएल -17 + गैर-टी कोशिकाओं की कम संख्या वाले रोगियों में बीमारियों से मुक्त रहने के साथ टी कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में सहसंबद्ध होना पाया गया था। यह पता चलता है कि आईएल -17 + गैर-टी कोशिकाएं ओपीएससीसी में एक खराब प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के साथ सहसंबद्ध हो सकती हैं, जो आईएल -17 और कैंसर के रोगियों में गरीबों के अस्तित्व के बीच वर्णित सहसंबंध के साथ एक समझौता है। वर्तमान में, उपन्यास multiparameter प्रतिदीप्ति आईएचसी तकनीकों 7 अलग fluorochromes तक का उपयोग कर विकसित किया जा रहा है और ट्यूमर microenvironment में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अधिक सटीक लक्षण वर्णन और स्थानीयकरण सक्षम हो जाएगा।
Introduction
ऑरोफरीनजील स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (ओपीएससीसी) ओरोफरीनक्स में होने वाली स्क्वैमस सेल कैंसर के एक विषम समूह हैं। ओपीएससीसी के लिए जोखिम कारक में मानव पपिलोमावायरस (एचपीवी) संक्रमण और शराब और तंबाकू का उपयोग 1 , 2 शामिल हैं । प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की भूमिका और यह कैसे एक नैदानिक सेटिंग में उपयोग करने के लिए बस का पता लगाया जा रहा है। ट्यूमर माइक्रोएनेरमेंट, प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा घुसपैठ की जाती है जो कैंसर साइट से आकर्षित होते हैं। हालांकि एक उच्च CD8 + साइटोटोक्सिक टी सेल आवृत्ति OPSCC रोगियों 3 में बेहतर अस्तित्व के साथ जोड़ा गया है Tregs और Th17 कोशिकाओं सहित अन्य टी सेल सबसेट,, की भूमिका अभी स्पष्ट नहीं 4 है। जबकि टी 1 और थिए 17 कोशिकाओं को ट्यूमर कोशिकाओं को लक्षित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में सहायता करने के लिए माना जाता है, Tregs अन्य टी कोशिकाओं 5 की गतिविधि को दबाने के लिए उनकी क्षमताओं के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है। हालांकि, टी की उपस्थितिविभिन्न ट्यूमर प्रकार 6 में अनुकूल और प्रतिकूल प्रतिक्रियाओं के साथ सहसंबंध होना पाया गया है चूंकि खून में मौजूद सभी प्रतिरक्षा कोशिकाओं में ट्यूमर में घुसपैठ नहीं होती है, इसलिए स्थानीय ट्यूमर माइक्रोएनरिवेशन का अध्ययन करते हुए ट्यूमर के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का सबसे विश्वसनीय उपाय प्रदान करता है। इस अध्ययन का उद्देश्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संख्याओं और प्रकारों और नैदानिक परिणामों के बीच के संबंधों को निर्धारित करना है। मानव OPSCC में विभिन्न टी-सेल उप-जनसंख्याओं की संख्या और स्थानीयकरण का विश्लेषण करने के लिए हमने चार-रंग प्रतिदीप्ति आईएचसी इमेजिंग का इस्तेमाल किया।
हम कुल टी लिम्फोसाइट्स (CD3 +), Th17 कोशिकाओं, और प्रतिरक्षा को दबाने वाली Foxp3 + Tregs, जिसका भेदभाव मार्ग बारीकी Th17 कोशिकाओं से संबंधित है पर जोर दिया। Th17 कोशिकाओं को सीडी 3 और आईएल -17 के संयोजन के अनुसार दिखाया गया है। गैर-टी कोशिकाओं 7 द्वारा साइटोकिन आईएल -17 का भी उत्पादन किया जा सकता है। हमने इंट्रा-एपिट का वितरण निर्धारित किया हैओएलएससीसी मामलों की एक बड़ी श्रृंखला में हेलियल और स्ट्रॉमल टी कोशिकाएं, टे्रग्स, थिय 17 और आईएल -17 + गैर-टी कोशिकाएं और रोगी के अस्तित्व के साथ सहसंबंधों का विश्लेषण किया। मल्टीकोलोर फ्लोरोसेंस आईएचसी का उपयोग सीडी 3, फॉक्सपॉ, और आईएल -17 की अभिव्यक्ति की पहचान करने के लिए किया गया था, जिसमें डीएपीआई काउंटरस्टेन के साथ संयोजन किया गया था। इस परख दोनों ट्यूमर कोशिकाओं (डीएपीआई परमाणु धुंधला होकर) और घुसपैठ कर टी सेल आबादी (विभिन्न मार्करों के संयोजन का उपयोग करके) की आसान और स्पष्ट पहचान के लिए अनुमति दी गई है। नमूना तैयार करने और धुंधला होने के बाद, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप और इमेजिंग सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल विभिन्न फ्लोरोसेंट रंगों को अलग करने के लिए किया गया था और ट्यूमर एपिथेलियम और ट्यूमर से जुड़े स्ट्रोडा दोनों में मौजूद संख्या और प्रकार के कोशिकाओं को निर्धारित करने के लिए उपयोग किया गया था।
ट्यूमर या परिधीय नमूनों ( यानी रक्त या जलोदरियों) की उड़ान (सीआईटीओएफ) के विश्लेषण के समय प्रवाह cytometry विश्लेषण या cytometry, प्रतिदीप्ति सेल आबादी का मात्रामान और phenotype करने के लिए एक वैकल्पिक परख है। इसका उपयोग करनातकनीक, विभिन्न सेल प्रकारों के स्थानीयकरण और रिश्तेदार वितरण के बारे में सभी जानकारी खो जाती है। परिधीय नमूनों का उपयोग और विश्लेषण भी जानकारी प्रदान नहीं करता है कि किस कोशिका के ट्यूमर माइक्रोएनेरमेंट को घुसपैठ करने में सक्षम हैं। रक्त और ऊपरी प्रतिरक्षा-कोशिका के विश्लेषण को ट्यूमर के ऊतक 8 , 9 के प्रसूति सेल घुसपैठ के phenotype और आवृत्ति को प्रतिबिंबित नहीं किया गया है।
एक अन्य विकल्प उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग होता है प्रतिदीप्ति इमेजिंग पर इस तकनीक का एक फायदा ऊतक autofluorescence की अनुपस्थिति है। हालांकि कुछ नमूनों में अधिक autofluorescence- विशेष रूप से एरिथ्रोसाइट्स होते हैं, लेकिन न्युट्रोफिलिक ग्रैन्यूलोसाइट्स सहित अन्य सेल प्रकार, इन क्षेत्रों को आसानी से लगभग सभी नमूनों के विश्लेषण में हटाया जा सकता है। Immunofluorescence लक्षित प्रतिदीप्ति के एक पैनल का उपयोग करके एक नमूने में कई मार्करों का विश्लेषण करने का लाभ प्रदान करता हैएनटी तरंग दैर्ध्य यह एक विशिष्ट एंटीजन के लिए पर्याप्त मात्रा में लेबलों की कमी और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी आइसोटाइप की कमी के कारण उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के लिए एक ही हद तक वर्तमान में असंभव है।
वर्णित बहुरंगा प्रतिदीप्ति आईएचसी तकनीक का उपयोग विभिन्न प्रतिरक्षा सेल आबादी, साथ ही ट्यूमर सेल-व्यक्त किए गए अणुओं जैसे मानव लैकोसाइट एंटीजन (एचएलए) और पीडी-एल 1 10 , 11 , के अध्ययन के लिए कई अलग-अलग कैंसर प्रकारों और एंटीबॉडी संयोजनों में किया गया है । 12 कई विभिन्न प्रकार के नमूनों और एंटीबॉडी का उपयोग करके प्रोटोकॉल स्थापित और मान्य किया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल के लिए वर्णित है, सबसे महत्वपूर्ण कदमों में से एक में इस्तेमाल किया गया प्राथमिक एंटीबॉडी का सही कमजोर पड़ने का निर्धारण करना है। इन विशिष्ट एलेक्सा-लेबल एंटीबॉडी के निर्माता द्वारा सुझाए ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
सिमोन पंट को डच कैंसर सोसायटी से UL2010-4801 अनुदान का समर्थन किया गया था। हम मूल पत्र के सभी सह-लेखक को धन्यवाद देना चाहेंगे कि यह जॉव प्रोटोकॉल निम्न पर आधारित है: एमिली ए। द्रोणकर, मारीज जेपी वेल्टर, रीन्सेक गोमेडेन्स, सेनदा कोलजेनोविक, एलिजाबेथ ब्लोमेना, पीटर जे एफ स्निज्डर्स, अरको गॉर्टर, और एसजोर्ड वैन डेर बर्ग
Materials
| Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor | Milestone and Histostar | Automated tissue processor | |
| Histostar | Thermo Scientific | Tissue block embedding machine | |
| Formaldehyde | Baker | ||
| Xylol | Merck | ||
| Ethanol | Merck | ||
| milliQ water | Elaga Purelab Chorus | ||
| Paraffin wax/Paraclean | Klinipath | 5079A | |
| Microtome tissue holder | Leica | RM225 | |
| Flex IHC side | Dako | Tissue slide | |
| Tris | Merk-Milipore | 1,083,821,000 | |
| EDTA | Baker | 1073 | |
| PBS | Bio-Rad | BUF036A | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Rabbit anti-CD3 | Abcam | ab828 | Titrate required antibody dilution |
| Mouse IgG1 anti-FoxP3 | Abcam | ab20034 | Titrate required antibody dilution |
| Goat IgG anti-IL-17 | R&D Systems | AF-317-NA | Titrate required antibody dilution |
| Rabbit Ig isotype control antibody | Abcam | ab27472 | Use at same final concentration as anti-CD3 |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | ab91353 | Use at same final concentration as anti-FoxP3 |
| Goat IgG isotype control antibody | ThermoFisher Scientific | 02-6202 | Use at same final concentration as anti-IL-17 |
| Donkey anti-rabbit IgG A546 | ThermoFisher Scientific | A10040 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-mouse-A647 | ThermoFisher Scientific | A31571 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-goat IgG A488 | ThermoFisher Scientific | A11055 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| VectaShield containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objective | Zeiss | 420852-9972-720 | |
| LSM Zen Software | Zeiss | version 2009 | |
| LSM Image Browser | Zeiss | version 4.2.0.121 | Available to download at www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html. |
| SPSS | IBM Corp. | version 20.0 | |
| ImageJ | version 1.50i | Available to download at http://rsb.info.nih.gov/ij. |
References
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