Fargelysfluorescensimmunohistokjemi av T-celle-subpopulasjoner i Archival Formalin-fikserte, paraffin-innebygde humane Orofaryngeale Squamous Cell Karsinomeksempler
Summary
Multiparameterfluorescensimmunohistokjemi kan brukes til å vurdere antall, relativ fordeling og lokalisering av immuncellepopulasjoner i tumormikromiljøet. Dette manuskriptet beskriver bruken av denne teknikken for å analysere T-celle subpopulasjoner i orofaryngealkreft.
Abstract
Firefargesfluorescensimmunohistokjemi (IHC) -teknikken er en metode for å kvantifisere cellepopulasjoner av interesse mens man tar hensyn til deres relative fordeling og lokalisering i vevet. Denne teknikken har blitt brukt i stor grad for å studere immuninfiltrasjonen i ulike svulst typer. Vaskemiljøet er infiltrert av immunceller som er tiltrukket av svulstoffet. Forskjellige immuncellepopulasjoner har blitt funnet å spille forskjellige roller i svulmemiljøet og å ha en annen innvirkning på sykdomsutfallet. Dette manuskriptet beskriver bruken av multiparameter fluorescens IHC på oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC) som et eksempel. Denne teknikken kan utvides til andre vevsprøver og celletyper av interesse. I den presenterte studien analyserte vi det intraepiteliale og stromale rommet av en stor OPSCC kohorte (n = 162). Vi fokuserte på totalt T-lymfocytter (CD3 + ), immunosuppressive regulatOry-T-celler (Tregs, dvs. FoxP3 + ) og T helper 17 (Th17) celler ( dvs. IL-17 + CD3 + ) ved hjelp av et nukleært motstander for å skille tumorepitel fra stroma. Et høyt antall T-celler viste seg å være korrelert med forbedret sykdomsfri overlevelse hos pasienter med lavt antall intratumorale IL-17 + ikke-T-celler. Dette antyder at IL-17 + ikke-T-celler kan være korrelert med en dårlig immunrespons i OPSCC, som er i samsvar med korrelasjonen beskrevet mellom IL-17 og dårlig overlevelse hos kreftpatienter. For tiden utvikles nye multifarameterfluorescens-IHC-teknikker ved bruk av opptil 7 forskjellige fluorokromer og vil muliggjøre en mer nøyaktig karakterisering og lokalisering av immunceller i svulmemiljøet.
Introduction
Oropharyngeal squamous cell carcinomas (OPSCCs) er en heterogen gruppe av squamouscellecancer som stammer fra oropharynx. Risikofaktorer for OPSCC inkluderer humant papillomavirus (HPV) infeksjon og bruk av alkohol og tobakk 1 , 2 . Rollen av immunresponsen og hvordan du bruker dette i en klinisk setting, begynner bare å bli utforsket. Vaskemiljøet er infiltrert av immunceller som er tiltrukket av kreftområdet. Selv om en høy CD8 + cytotoksisk T-cellefrekvens har vært korrelert med forbedret overlevelse hos OPSCC-pasienter 3 , er rollen til andre T-celle-undergrupper, inkludert Tregs og Th17-celler, fortsatt uklar 4 . Mens Th1- og Th17-celler skal bistå i immunresponsmålrørende tumorceller, er Tregs velkjent for deres evne til å undertrykke aktiviteten til andre T-celler 5 . Imidlertid er tilstedeværelsen av TRegs har blitt funnet å korrelere med både gunstige og ugunstige svar i forskjellige svulst typer 6 . Siden ikke alle immunceller som er tilstede i blodet, infiltrerer svulsten i samme grad, gir studiet av det lokale tumormikromiljøet det mest pålitelige målet på immunresponsen rettet mot svulsten. Målet med denne studien er å bestemme korrelasjonen mellom tallene og typene immunceller og det kliniske utfallet. Vi brukte firefarget fluorescens IHC-bildebehandling for å analysere antall og lokalisering av ulike T-celle subpopulasjoner i human OPSCC.
Vi fokuserte på totalt T-lymfocytter (CD3 + ), Th17-celler og immunosuppressive FoxP3 + Tregs, hvis differensieringsvei er nært relatert til Th17-celler. Th17-celler kjennetegnes av kombinasjonen av CD3 og IL-17. Cytokinet IL-17 kan også fremstilles av ikke-T-celler 7 . Vi bestemte fordelingen av intraepitHelial og stromal T-celler, Tregs, Th17 og IL-17 + ikke-T-celler i en stor serie OPSCC-tilfeller og analyserte korrelasjonene med pasientoverlevelse. Multikolor fluorescens IHC ble brukt til å identifisere ekspresjonen av CD3, Foxp3 og IL-17, i kombinasjon med en DAPI-motstrekning. Denne analysen tillot for enkel og klar identifikasjon av begge tumorceller (ved bruk av DAPI-nukleær farging) og infiltrerende T-cellepopulasjoner (ved hjelp av en kombinasjon av forskjellige markører). Etter prøvepreparering og -farging ble et fluorescerende mikroskop og bildebehandlingsprogram brukt for å separere de forskjellige fluorescerende fargene som ble brukt og for å bestemme antall og type celler som er tilstede i både tumorepitelet og den tumorassosierte stroma.
Et alternativt assay for å kvantifisere og fenotype immuncellpopulasjoner er strømningscytometrianalyse eller cytometri ved tidstroende (CyTOF) analyse av tumor eller perifere prøver ( dvs. blod eller ascites). Bruk detteTeknikk, går all informasjon om lokalisering og relativ fordeling av de forskjellige celletyper tapt. Bruken og analysen av perifere prøver gir også ikke informasjon om hvilke celler som er i stand til å infiltrere tumormikromiljøet. Blod- og asciteimmun-celleanalyser har vist seg å ikke reflektere fenotypen og hyppigheten av immuncelleinfiltrering av tumorvevet 8 , 9 .
Et annet alternativ er bruken av lysfeltmikroskopi. En fordel ved denne teknikken over fluorescensbilder er fraværet av vevs autofluorescens. Selv om enkelte prøver inneholder mer autofluorescens-spesielt erytrocytter, men også andre celletyper, inkludert nøytrofile granulocytter, kan disse områdene enkelt fjernes ved analyse av nesten alle prøver. Immunofluorescens gir fordelen av å analysere flere markører i en prøve ved å bruke et panel med målrettet fluoresceNt bølgelengder. Dette er for øyeblikket umulig i samme grad for lysfeltmikroskopi på grunn av mangelen på et tilstrekkelig antall etiketter og kommersielt tilgjengelige antistoffisotyper for et bestemt antigen.
Den flerfarvede fluorescens-IHC-teknikken som er beskrevet her, har blitt brukt i mange forskjellige krefttyper og antistoffkombinasjoner for å studere forskjellige immuncellepopulasjoner, så vel som tumorcelle-uttrykte molekyler, slik som humane leukocytantigener (HLA) og PD-L1 10 , 11 , 12 . Protokollen er etablert og validert ved bruk av mange forskjellige typer prøver og antistoffer.
Protocol
Representative Results
Discussion
For protokollen som er beskrevet, er et av de mest kritiske trinnene å bestemme riktig fortynning av de primære antistoffene som brukes. Fortynningen av de merkede sekundære antistoffene var 1: 200, som anbefalt av produsenten av disse spesifikke Alexa-merkede antistoffene. Fortynningen av de primære antistoffene skal da bestemmes ved en seriell fortynning, fortrinnsvis ved bruk av to forskjellige prøver av den tilsiktede vevstype (i dette tilfellet OPSCC). Den optimale arbeidsfortynningen er fortynningen der et kl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Simone Punt ble støttet av UL2010-4801 fra det nederlandske kreftforeningen. Vi vil gjerne takke alle medforfatterne av det originale papiret at denne JoVE-protokollen er basert på: Emilie A. Dronkers, Marij JP Welters, Renske Goedemans, Senada Koljenović, Elisabeth Bloemena, Peter JF Snijders, Arko Gorter og Sjoerd van Der Burg.
Materials
| Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor | Milestone and Histostar | Automated tissue processor | |
| Histostar | Thermo Scientific | Tissue block embedding machine | |
| Formaldehyde | Baker | ||
| Xylol | Merck | ||
| Ethanol | Merck | ||
| milliQ water | Elaga Purelab Chorus | ||
| Paraffin wax/Paraclean | Klinipath | 5079A | |
| Microtome tissue holder | Leica | RM225 | |
| Flex IHC side | Dako | Tissue slide | |
| Tris | Merk-Milipore | 1,083,821,000 | |
| EDTA | Baker | 1073 | |
| PBS | Bio-Rad | BUF036A | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Rabbit anti-CD3 | Abcam | ab828 | Titrate required antibody dilution |
| Mouse IgG1 anti-FoxP3 | Abcam | ab20034 | Titrate required antibody dilution |
| Goat IgG anti-IL-17 | R&D Systems | AF-317-NA | Titrate required antibody dilution |
| Rabbit Ig isotype control antibody | Abcam | ab27472 | Use at same final concentration as anti-CD3 |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | ab91353 | Use at same final concentration as anti-FoxP3 |
| Goat IgG isotype control antibody | ThermoFisher Scientific | 02-6202 | Use at same final concentration as anti-IL-17 |
| Donkey anti-rabbit IgG A546 | ThermoFisher Scientific | A10040 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-mouse-A647 | ThermoFisher Scientific | A31571 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-goat IgG A488 | ThermoFisher Scientific | A11055 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| VectaShield containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objective | Zeiss | 420852-9972-720 | |
| LSM Zen Software | Zeiss | version 2009 | |
| LSM Image Browser | Zeiss | version 4.2.0.121 | Available to download at www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html. |
| SPSS | IBM Corp. | version 20.0 | |
| ImageJ | version 1.50i | Available to download at http://rsb.info.nih.gov/ij. |
References
- Westra, W. H. The changing face of head and neck cancer in the 21st century: the impact of HPV on the epidemiology and pathology of oral cancer. Head Neck Pathol. 3 (1), 78-81 (2009).
- Rietbergen, M. M., et al. Human papillomavirus detection and comorbidity: critical issues in selection of patients with oropharyngeal cancer for treatment De-escalation trials. Ann Oncol. 24 (11), 2740-2745 (2013).
- Wallis, S. P., Stafford, N. D., Greenman, J. Clinical relevance of immune parameters in the tumor microenvironment of head and neck cancers. Head Neck. 37 (3), 449-459 (2015).
- Ye, J., Livergood, R. S., Peng, G. The role and regulation of human Th17 cells in tumor immunity. Am J Pathol. 182 (1), 10-20 (2013).
- Amedei, A., et al. Ex vivo analysis of pancreatic cancer-infiltrating T lymphocytes reveals that ENO-specific Tregs accumulate in tumor tissue and inhibit Th1/Th17 effector cell functions. Cancer Immunol Immunother. 62 (7), 1249-1260 (2013).
- Whiteside, T. L. What are regulatory T cells (Treg) regulating in cancer and why?. Semin Cancer Biol. 22 (4), 327-334 (2012).
- Punt, S., et al. Angels and demons: Th17 cells represent a beneficial response, while neutrophil IL-17 is associated with poor prognosis in squamous cervical cancer. Oncoimmunology. 4 (1), e984539 (2015).
- Bamias, A., et al. Significant differences of lymphocytes isolated from ascites of patients with ovarian cancer compared to blood and tumor lymphocytes. Association of CD3+CD56+ cells with platinum resistance. Gynecol Oncol. 106 (1), 75-81 (2007).
- Gasparoto, T. H., et al. Patients with oral squamous cell carcinoma are characterized by increased frequency of suppressive regulatory T cells in the blood and tumor microenvironment. Cancer Immunol Immunother. 59 (6), 819-828 (2010).
- Jordanova, E. S., et al. Human leukocyte antigen class I, MHC class I chain-related molecule A, and CD8+/regulatory T-cell ratio: which variable determines survival of cervical cancer patients?. Clin Cancer Res. 14 (7), 2028-2035 (2008).
- van Esch, E. M., et al. Alterations in classical and nonclassical HLA expression in recurrent and progressive HPV-induced usual vulvar intraepithelial neoplasia and implications for immunotherapy. Int J Cancer. 135 (4), 830-842 (2014).
- Heeren, A. M., et al. Prognostic effect of different PD-L1 expression patterns in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the cervix. Mod Pathol. 29 (7), 753-763 (2016).
- Punt, S., et al. A beneficial tumor microenvironment in oropharyngeal squamous cell carcinoma is characterized by a high T cell and low IL-17(+) cell frequency. Cancer Immunol Immunother. 65 (4), 393-403 (2016).
- Kirkwood, B. R., Sterne, J. A. C. . Essential Medical Statistics. , (2003).
- Kleinbaum, D. G., Klein, M. . Survival Analysis: A Self-Learning Text. , (2005).
- Fabre, J., et al. Targeting the Tumor Microenvironment: The Protumor Effects of IL-17 Related to Cancer Type. Int J Mol Sci. 17 (9), (2016).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. J Immunother Cancer. 3 (47), (2015).
