Способ получения рекомбинантного белка mCD1d в клетках насекомых.
Summary
Метод подготовить клеток насекомых и заразить их бакуловирус для целей производства рекомбинантных proteinand mCD1d генерации mCD1d тетрамеров.
Abstract
CD1 белки составляют третий класс антиген-представляющих молекул. Они поверхности клетки гликопротеинов, выраженное в примерно 50-кДа гликозилированного тяжелые цепи, которые нековалентно связанных с бета2-микроглобулина. Они связывают липиды, а не пептиды. Хотя их структура подтверждает сходство CD1 белков MHC класса I и класса II антиген представляющих молекул, mCD1d канавки относительно узких, глубоких, и высоко гидрофобными и имеет два обязательных карманы вместо нескольких мелких карманах описано для классической MHC- закодированный антиген-представляющих молекул. На основании их аминокислотных последовательностей, таких hydrobphobic канавка обеспечивает идеальную среду для связывания липидных антигенов.
Естественных киллеров Т (НКТ) клетки используют их TCR признать гликолипиды обязаны или представленных CD1d. Т-клетки реагируют на липиды представленных CD1 были вовлечены в защиту от аутоиммунных и инфекционных заболеваний и в опухолевой отказа. Таким образом, способность идентифицировать, очистить и отслеживать реакцию CD1-реактивного ячейки NKT имеет большое значение. Поколение тетрамеров альфа галактозил церамида (-Galcer) с CD1d имеет значительно углубить понимание биологии клетки NKT. Тетрамеров построены из других CD1 молекул также был сформирован, и эти новые реагенты значительно расширили знания о функции липидов реактивных Т-клеток, с потенциалом использования в целях мониторинга ответ на основе липидов вакцин и диагностики аутоиммунных заболеваний и других лечения.
Protocol
Discussion
В этой процедуре показано, как инициировать, растут, инфицировать клетки насекомых и как титр бакуловирус с помощью этих клеток. Наиболее важные аспекты этой процедуры не требуют технического обслуживания клеток и знать точное титр бакуловирус. После того как вы сформировали CD1 тетрамеров, они мо…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Express Five SFM | Serum Free Medium | Invitrogen | 10486025 | |
| High Five TM | Insect Cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Glutamine Pen strep | Antibiotics | Invitrogen | 10378-016 | |
| 25cm2 TC Flask | Plastic | Fisher | 10-126-28 | |
| 175 cm2 TC Flask | Plug seal flask | Fisher | 10-126-8 | |
| Erlenmeyer Flask | Cell Culture Flask | Fisher | 07 200 672 | |
| YM 30 Concenterator | 30,000 MWCO | Millipore | UFC 903096 | |
| FPLC equipment | GE Healthcare | |||
| BrA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Ni-NTA Agarose Column | His Tag Protein Purification Column | GE Healthcare | ||
| Desalting column | To get Rod of Salt from Protein | GE Healthcare | ||
| MonoQ Column | Anion Exchange Chromatgraphy | GE Healthcare | ||
| S200 Column | Size Exclusion Chromatography | GE Healthcare | ||
| alpha-Galcer | Glycolipid | |||
| PE- Streptavidin | For conjugating Protein | Molecular Probe | S-866 |
References
- Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers. J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).
- Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells. Nature. 434, 520-525 (2005).
- Naidenko, O. V., Maher, J. K., Ernst, W. A., Sakai, T., Modlin, R. L., Kronenberg, M. Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules. J. Exp. Med. 190, 1069-1080 (1999).
- Porcelli, S. A. The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules. Adv. Immunol. 59, 1-98 (1995).
- Sidobre, S., Kronemberg, M. CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells. J. Immunol. 169, 1340-1348 (2002).
