蜂群的丧失对作物授粉服务构成了挑战。当前的传粉昆虫保护措施需要采用一种替代方法，即利用驱避性化学物质来尽量减少蜜蜂与有害农药的接触。本文提供了用于筛选蜜蜂驱避剂的视觉追踪实验方案的详细方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
欧洲蜜蜂Apis mellifera L.是一种具有重要经济和农业价值的传粉昆虫，每年产生数十亿美元的经济效益。自1947年以来，美国和许多欧洲国家的蜜蜂蜂群数量持续下降。多种因素导致了这一趋势，其中包括蜜蜂无意中接触农药的情况。因此，有必要开发新的方法和监管措施以减少这些传粉昆虫对农药的暴露。其中一种策略是使用驱避性化学物质，使蜜蜂远离刚施用过农药的作物。本文描述了一种用于评估蜜蜂对特定驱避性化学物质产生回避行为的实验方案。采集蜜蜂采集蜂后，在测试前15小时将其置于培养箱中禁食过夜。将单只蜜蜂分别放入培养皿中，培养皿中央放置蔗糖-琼脂糖立方体（对照处理）或含化合物的蔗糖-琼脂糖复合立方体（驱避处理）。培养皿作为行为观察 arena，置于光源箱内并用摄像机记录蜜蜂的运动行为，通过视频追踪软件进行分析。每种处理（8个对照组和8个驱避组）均持续观察10分钟，并使用新的蜜蜂重复每组实验。本文结果表明，当蔗糖-琼脂糖立方体中含有特定化合物时，蜜蜂会对其产生回避行为；而对不含添加化合物的蔗糖-琼脂糖立方体则表现出趋向性。
引言
欧洲蜜蜂， Apis mellifera L.是一种具有经济和农业重要性的昆虫，其提供的授粉服务全球估值超过2000亿美元1在美国和欧洲，蜜蜂蜂群数量一直在下降。美国已经失去了 ca1947年至2008年间，美国管理的蜜蜂种群减少了60%，而欧洲也已失去 ca1961年至2007年间下降了27%2,3可能导致蜂群损失数量增加的因素有很多，包括但不限于寄生虫侵扰、病原体感染、养蜂实践以及农药使用。2-4.
蜜蜂可能通过两种主要途径接触到农药。蜂群在蜂巢外接触农药的情况可能发生在觅食个体接触到为防治害虫而喷洒了化学药剂的作物时。蜂群在蜂巢内接触农药的情况则可能发生在养蜂人使用化学物质控制蜂巢内害虫和病原体（如螨虫、细菌和微孢子虫）时4。在美国和加拿大的24个蜂场采集的蜂蜡、花粉和蜜蜂样本中均已检测出农药残留5,6。农药对蜜蜂的影响包括急性毒性以及亚致死效应，例如麻痹、迷失方向、行为改变....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 准备蔗糖-琼脂糖凝胶块
- 称取8 g蔗糖，放入50 mL锥形瓶中。
- 将20 mL去离子水加入锥形瓶中，通过旋转摇动使糖溶解。
- 称取 170 mg 琼脂糖，加入糖溶液中。
- 将糖-琼脂糖溶液放入微波炉中，高火加热25秒。使琼脂糖完全溶解于糖溶液中。
- 让烧瓶和糖-琼脂糖溶液冷却。
注意：烧瓶应冷却至手感不热，但切勿让溶液凝固。- 为准备对照处理用的糖-琼脂糖凝胶块，将半冷却的糖-琼脂糖溶液倒入称量皿模具中。
注意：称量舟模具的尺寸为 1.5 x 1.5 x 0.3 cm3. - 为制备用于驱避处理的含糖琼脂糖复合物小块，将所需量的化合物加入半冷却的溶液中（例如，1% DEET 的蔗糖-琼脂糖溶液（v/v）。轻轻摇动烧瓶使化合物混匀，然后将溶液倒入称量皿模具中。
注意：此时将制备八个对照模具和八个测试模具。对照模具中不含驱避剂。
- 为准备对照处理用的糖-琼脂糖凝胶块，将半冷却的糖-琼脂糖溶液倒入称量皿模具中。
- 将糖-琼脂糖凝胶块连同模具一起放入冰箱冷却5-10分钟。从称量舟模具中取出已凝固的糖-琼脂糖凝胶块，放入装有湿润滤纸的塑料容器中。
- 将容器放入冰箱中储存。蔗糖-琼脂糖凝胶块应在制备后7天内使用。
2. 编程视频追踪软件和实验设置<....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
开发了一种视觉追踪方案，用于记录蜜蜂在目标区域停留的时间，该区域提供糖-琼脂糖立方体（对照处理）或含化合物的糖-琼脂糖立方体（驱避处理）。通过统计软件分析记录的时间，并以柱状图形式报告蜜蜂在目标区域停留的平均时间±标准误差。本方案中使用DEET作为阳性对照，因其是昆虫驱避剂测试的金标准。提供糖-琼脂糖立方体（阴性对照）的蜜蜂在目标区域停留时间为343 ± 26秒，而提供糖-琼脂糖-DEET（驱避剂）的蜜蜂在目标区域停留时间为16 ± 4秒图7）。DEET 显著减少了蜜蜂在目标区域停留的时间 ca. 95% 与对照处理相比。
接下来通过该方案筛选出对蜜蜂具有驱避作用的感兴趣化合物。图8A显示了一种化合物，该化合物不会阻止蜜蜂接近目标区域的食物源。在对照培养皿中，蜜蜂在目标区域停留的平均时间为约 352 ± 60 s，而在含有掺入化合物A的蔗糖-琼脂糖块的培养皿中，蜜蜂停留的平均时间为<.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本视觉追踪方案提供了一种相对快速简便的方法，用于筛选对蜜蜂具有驱避作用的化学物质。目前尚无针对蜜蜂化学驱避剂的推荐实验室测试方案。以往的半野外和全野外研究曾考察过蜜蜂驱避剂14,15；然而所述方案耗时较长、劳动强度大，且需要超出普通实验室条件的额外设施资源。本方案旨在作为对化合物进行半野外或全野外测试前，评估其对蜜蜂驱避效果的初步筛选手段。
在蜂巢外对个体蜜蜂进行化学驱避剂筛选时存在一些挑战。例如，蜜蜂是社会性昆虫，其在蜂巢内的行为依赖于信息素的作用14。本实验方案需要使用不再接收信息素信号的个体，并对其进行饥饿处理。饥饿处理旨在标准化个体蜜蜂的取食反应。饥饿时间是通过一项持续24小时的时间进程研究确定的。需要注意的是，饥饿可能对个体蜜蜂产生不利影响。例如，蜜蜂在从蜂巢采集后18小时会变得迟钝。基于这些观察结果，本实验选择在蜜蜂采集后饥饿15小时。
为避免筛选失败.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Thomas Kuhar 博士提供视觉追踪软件和设备。感谢 James Wilson 和 Scott O'Neal 提供的技术支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 50 mL 锥形瓶 | Kimax | 26500-50 | 用于制备糖/琼脂糖块 |
| 糖 | Kroger | 任何类似产品均可替代 | |
| 去离子水 | 实验室自备 | ||
| 琼脂糖 | Apex | 20-102 | 用于制备糖/琼脂糖块 |
| 琼脂糖块模具（称量舟） | 任何能够制备出尺寸为 1.5 cm × 1.5 cm × 0.3 cm 的糖/琼脂糖块的模具均可替代 | ||
| EthoVision XT | Noldus | 视频追踪软件 | |
| 633 nm 发光二极管（LED） | Cyron | HTP904E | 将这些光源安装于自制光源箱中，从下方照射实验区域。 光源箱为一个简单的木质结构，顶部覆盖磨砂塑料或有机玻璃板，使光线向上均匀散射，避免反光。 |
| 笔记本电脑或台式电脑 | Dell | Inspiron One 2305 | 用于运行视频追踪软件。任何可运行该视觉追踪软件的计算机设备均可替代 |
| 养蜂防护服 | Dadant & Sons Inc | V0126 | 任何具备防护头罩和外套的装备均可替代 |
| 蜂箱工具 | Dadant & Sons Inc | M00757 | 用于开启蜜蜂蜂箱 |
| 蜜蜂容器 | 任何适合容纳和储存蜜蜂的容器均可替代 | ||
| 细尖无损伤镊子 | Bioquip | 4748 | 用于挑选单只蜜蜂 |
| 直径 9 cm 培养皿 | Fisher Scientific | S01778 | 作为实验区域，用于在视频追踪期间容纳单只蜜蜂 |
| 记录设备（摄像机） | Basler | acA-1300-60gm | 任何能够清晰记录实验对象并将文件传输至计算机的设备均可替代 |
| GraphPad Prism | Graphpad | 任何具备统计分析功能的软件均可替代 |
参考文献
- Gallai, N., Salles, J. M., Settele, J., Vaissière, B. E. Economic valuation of the vulnerability of world agriculture confronted with pollinator decline. Ecol Econ. 68 (3), 810-821 (2009).
- van Engelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and th....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
