מיצוי וטיהור של פוליפנולים מאבקת ברי מיובשים בהקפאה לטיפול בתאי שריר חלקים וסקולריים<em> במבחנה</em
Summary
עבודה זו מפרטת שיטה שלב אחר שלב להכנת תמציות פוליפנול עשיר מאבקת יער מיובש בהקפאה. בנוסף, הוא מספק תיאור יסודי של איך להשתמש אלה poliphenol עשיר תמציות בתרבית תאים בנוכחות של הפפטיד הורמון אנגיוטנסין II (Ang II) באמצעות כלי דם וסקולרים חלקות (VSMCs).
Abstract
מחקרים אפידמיולוגיים מצביעים על עלייה בצריכת פלבנואידים עם ירידה בתמותה כתוצאה ממחלות לב וכלי דם (CVD) בארה"ב (ארה"ב) ובאירופה. פירות יער נצרכים באופן נרחב בארה"ב ויש להם תוכן פוליפנולי גבוה. פוליפנולים הראו אינטראקציה עם מטרות מולקולריות רבות כדי להפעיל פונקציות ביולוגיות חיוביות רבות, כולל נוגדי חמצון, אנטי דלקתיות, ואפקטים cardioprotective. פוליפנולים המבודדים מאוכמניות (BL), פטל (RB) ופטל שחור (BRB) מפחיתים את הלחץ החמצוני ואת הזיהום הסלולרי בתגובה לאנגיוטנסין II (Ang II). עבודה זו מספקת תיאור מפורט של הפרוטוקול המשמש להכנת תמציות פוליפנול מ גרגרים יבשים להקפיא. תמציות פוליפנול מ אבקת ברי יבשים להקפיא בוצעו באמצעות אתנול מימית 80% ושיטת מיצוי קולי. התמצית הגולמית היתה מטוהרת ומנותקת באמצעות כלורופורם ואתיל אצטט,בהתאמה. ההשפעות של תמציות גס ו מטוהרים נבדקו על כלי הדם חלקות תאים (VSMCs) בתרבות.
Introduction
פוליפנולים הם תרכובות המכילות לפחות טבעת פנולית אחת במבנה שלהם נמצאים בשפע בממלכת הצמח 1 . בני אדם כבר לצרוך צמחים אלפי שנים למטרות רפואיות מבלי להיות מודע לקיומם של תרכובות כאלה 2 . פירות וירקות רבים יש כמה תרכובות פוליפנוליות משותפות, אם כי עם כמויות שונות, כולל פלבנואידים, stilbenes, וחומצות פנוליות 3 . למרות polyphenols קשורות לעיתים קרובות עם פירות וירקות צבעוניים, זה לא נכון לחלוטין. לדוגמה, zeaxanthin ו xanthine נמצאים בירקות שאינם צבעוניים מאוד, כגון בצל ושום, אשר ממשפחת scallions והם קשורים עם יתרונות בריאותיים רבים 4 . מלבד היותו קשור למספר יתרונות בריאותיים 5 , polyphenols גם לשרת צמחים על ידי הגנה עליהם מפני חרקיםקרינה אולטרה סגולה. פוליפנולים נמצאים בדרך כלל בתזונה האנושית ונחשבים לחומרים נוגדי חמצון רבי עוצמה, שכן הם יכולים לסקור את מימן החמצן (ROS) 6 , 7 , 8 . יש להם גם אנטי דלקתיות 9 , מיקרוביאלית 10 , נגד יתר לחץ דם 11 , ו אנטי מסרטנים 12 , 13 נכסים.
מחקרים אפידמיולוגיים מראים קשר הפוך בין צריכת הפלבנואידים לבין מחלות לב וכלי דם (CVD) , 16 , 17 ותמותה 14 , 15 . פירות יער הם נצרך נרחב בארה"ב יש כמויות גבוהות של פוליפנולים, כולל פלבנואידים. לדוגמה, צריכת מיץ (BL) מיץ (300) מ"ל / ד) במשך שמונה שבועות ירדה באופן משמעותי לחץ דם סיסטולי בחולים דיסליפידים 18 . Jeong et al. 19 דיווחו כי גברים ונשים לפני יתר לחץ דם, שצרכו 2.5 גרם של תמצית פטל שחור (BRB) ביום, היו בעלי לחץ דם נמוך יותר 24 שעות ולילה בהשוואה לאלו שצרכו פלסבו. פטל (RB) הוריד את לחץ הדם תוך הגברת הביטוי של superoxide dissutase (SOD) בעכברי יתר לחץ דם באופן ספונטני 20 . זה הוכח לאחרונה כי BL, RB, ו BRB להפחית את רמות ROS ו ההזדקנות המושרה על ידי אנגיוטנסין II (אנג II) ב וסקולרים חלקות תאי שריר (VSMCs) 21 . בנוסף, חלק האנתוציאנינים מתמצית BL הפחית את הביטוי של סינתזה חנקתית חנקתית (iNOS) ועכב את פעילותו של גורם גרעיני kappa B (NF-κB) ו- Kinase של תאית (ERK) תאית (ERK) ב- Lipopolysaccharide (LPS) J774 תאיםהתחת = "xref"> 22. תמציות BRB הפחיתו את ההפעלה NF-κB ו cyclooxygenase 2 (COX-2) ביטוי במבחנה 23 , שיפור פרופיל השומנים, ומניעת היווצרות טרשת עורקים בעכברים הזנת דיאטה דלת שומן 24 . אנתוציאנינים, אשר נחשבים flavonoids שופע ביותר של פירות יער, לווסת את התגובה דלקתיים LPS- מגורה RAW 264.7 מקרופאגים על ידי הפחתת הגידול פקטור אלפא (TNF-α) הייצור 25 ולהפחית את התפשטות והגירה של VSMCs 26 .
מאז יש כבר עניין הולך וגובר בהבנת התפקיד של polyphenols בבריאות האדם ואת המחלה, חשוב כדי לייעל את שיטת החילוץ. ממיסים ממס הוא בשימוש נרחב למטרה זו, שכן הוא חסכוני לשחזור בקלות. במחקר זה, מיצוי ממס שימש עם אתנול, יחד עם ultioasonic בסיוע extractioN, שהותאמה מקים ולי 27 . הטיהור והתפלגות התמציות הגולמיות (CE) תוך שימוש בכלורופורם ובאתיל אצטט בוצעו כדי להשיג את החלק המופק מטחון (PE) שהותאם מקוויירס ואח ' . כמו כן, הושוו היעילות של תמציות פוליפנול גולמיות לעומת מטוהרים מ- BL בהפחתת הזירחון הבסיסי של ERK1 / 2, ודוגמאות מייצגות של ההשפעה המעכבת של תמצית פוליפנול BL מטוהרת על הפחתת אותות המושרה על ידי Ang II ב- VSMCs סופקו.
Protocol
Representative Results
Discussion
פוליפנולים מבודדים מהגרגרים מכילים קומפוזיציות שונות. פרוטוקול החילוץ המבוסס על אתנול המתואר כאן מאפשר זיהוי של רמות שונות של חומצות פנוליות ופלבונואידים המצויים בתמציות פוליפנול גולמיות ומטוהרות של BL ( טבלה 1 ). CE הועשר בחומצה גאלית, חומצה פרולית, חומצה 4-O-c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי איגוד הלב האמריקני (14GRNT20180028) ואת מדינת פלורידה מדינת המועצה על מחקר ויצירתיות (COFRS).
Materials
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich, Inc. | A9525-10MG | Treatment of VSMCs |
| β-actin | Sigma-Aldrich, Inc. | A2228 | Primary antibody (1:5000) |
| Blackberry fruit | Mercer Foods | Freeze-dried blackberry powder | |
| Catalase | Calbiochem | 219010 | Primary antibody (1:1000) |
| Chloroform | Biotech Grd, Inc. | 97064-678 | Preparation of purified polyphenol extracts |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-014-CV | Culture of VSMCs |
| Ethanol (absolute molecular biology grade) | Sigma-Aldrich, Inc. | E7023-500ML | Preparation of polyphenol extracts |
| Ethylacetate | Sigma-Aldrich, Inc. | 439169 | Preparation of purified polyphenol extracts |
| ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9102S | Primary antibody (1:500) |
| EDTA, 500 mM, pH 8.0 | Teknova, Inc. | E0306 | Lysis buffer |
| Freeze-Dryer | Labconco | VirTis Benchtop K | Preparation of polyphenol extracts |
| FBS | Seradigm | 1400-500 | Cell culture |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | Lysis buffer |
| NaCl | EMD Millipore, Inc. | 7760 | Lysis buffer |
| NaF | J.T.Baker, Inc. | 3688-01 | Lysis buffer |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, Inc. | 450243 | Lysis buffer |
| Na4P2O7 , decahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | S-9515 | Lysis buffer |
| phospho ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9101S | Primary antibody (1:1000) |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich, Inc. | P8340-5ml | Lysis buffer |
| Protein assay dye reagent | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 500-0006 | Protein concentration Measurement |
| PVDF transfer membrane | Thermo Scientific, Inc. | 88518 | Western blots |
| Rotatory Evaporator | Buchi Labortechnik | Rotavapor R3000 |
Preparation of polyphenol extracts |
| Sterile water | Mediatech, Inc. | 25-055-CV | Preparation of polyphenol extracts |
| Sonicator | QSonica, LLC | Q125 | Preparation of cell extracts |
| SOD2 | Enzo Life Sciences, Inc. | ADI-SOD-110-F | Primary antibody (1:1000) |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich, Inc. | X100 | Western blots |
| Whatman #2 filter paper | GE Healthcare, Inc. | 28317-241 | Preparation of polyphenol extracts |
References
- Morton, L. W., Abu-Amsha Caccetta, R., Puddey, I. B., Croft, K. D. Chemistry and biological effects of dietary phenolic compounds: relevance to cardiovascular disease. Clin Exp Pharmacol Physiol. 27 (3), 152-159 (2000).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev. 90 (3), 859-904 (2010).
- Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Remesy, C., Jimenez, L. Polyphenols: food sources and bioavailability. Am J Clin Nutr. 79 (5), 727-747 (2004).
- Griffiths, G., Trueman, L., Crowther, T., Thomas, B., Smith, B. Onions–a global benefit to health. Phytother Res. 16 (7), 603-615 (2002).
- Mazzoni, L., et al. The genetic aspects of berries: from field to health. J Sci Food Agric. 96 (2), 365-371 (2016).
- Wang, S. Y., Jiao, H. Scavenging capacity of berry crops on superoxide radicals, hydrogen peroxide, hydroxyl radicals, and singlet oxygen. J Agric Food Chem. 48 (11), 5677-5684 (2000).
- Choi, M. H., Shim, S. M., Kim, G. H. Protective effect of black raspberry seed containing anthocyanins against oxidative damage to DNA, protein, and lipid. J Food Sci Technol. 53 (2), 1214-1221 (2016).
- Forbes-Hernandez, T. Y., et al. The Healthy Effects of Strawberry Polyphenols: Which Strategy behind Antioxidant Capacity?. Crit Rev Food Sci Nutr. 56, S46-S59 (2016).
- Figueira, M. E., et al. Protective effects of a blueberry extract in acute inflammation and collagen-induced arthritis in the rat. Biomed Pharmacother. 83, 1191-1202 (2016).
- Daglia, M. Polyphenols as antimicrobial agents. Curr Opin Biotechnol. 23 (2), 174-181 (2012).
- Hügel, H. M., Jackson, N., May, B., Zhang, A. L., Xue, C. C. Polyphenol protection and treatment of hypertension. Phytomedicine. 23 (2), 220-231 (2016).
- Niedzwiecki, A., Roomi, M. W., Kalinovsky, T., Rath, M. Anticancer Efficacy of Polyphenols and Their Combinations. Nutrients. 8 (9), E552 (2016).
- Kresty, L. A., Mallery, S. R., Stoner, G. D. Black raspberries in cancer clinical trials: Past, present and future. J Berry Res. 6 (2), 251-261 (2016).
- Hertog, M. G., et al. Flavonoid intake and long-term risk of coronary heart disease and cancer in the seven countries study. Arch Intern Med. 155 (4), 381-386 (1995).
- Peterson, J. J., Dwyer, J. T., Jacques, P. F., McCullough, M. L. Associations between flavonoids and cardiovascular disease incidence or mortality in European and US populations. Nutr Rev. 70 (9), 491-508 (2012).
- Cassidy, A., et al. High anthocyanin intake is associated with a reduced risk of myocardial infarction in young and middle-aged women. Circulation. 127 (2), 188-196 (2013).
- Jacques, P. F., Cassidy, A., Rogers, G., Peterson, J. J., Dwyer, J. T. Dietary flavonoid intakes and CVD incidence in the Framingham Offspring Cohort. Br J Nutr. 114 (9), 1496-1503 (2015).
- Aghababaee, S. K., et al. Effects of blackberry (Morus nigra L.) consumption on serum concentration of lipoproteins, apo A-I, apo B, and high-sensitivity-C-reactive protein and blood pressure in dyslipidemic patients. J Res Med Sci. 20 (7), 684-691 (2015).
- Jeong, H. S., et al. Effects of Rubus occidentalis extract on blood pressure in patients with prehypertension: Randomized, double-blinded, placebo-controlled clinical trial. Nutrition. 32 (4), 461-467 (2016).
- Jia, H., et al. The antihypertensive effect of ethyl acetate extract from red raspberry fruit in hypertensive rats. Pharmacogn Mag. 7 (25), 19-24 (2011).
- Feresin, R. G., et al. Blackberry, raspberry and black raspberry polyphenol extracts attenuate angiotensin II-induced senescence in vascular smooth muscle cells. Food Funct. 7 (10), 4175-4187 (2016).
- Pergola, C., Rossi, A., Dugo, P., Cuzzocrea, S., Sautebin, L. Inhibition of nitric oxide biosynthesis by anthocyanin fraction of blackberry extract. Nitric Oxide. 15 (1), 30-39 (2006).
- Lu, H., Li, J., Zhang, D., Stoner, G. D., Huang, C. Molecular mechanisms involved in chemoprevention of black raspberry extracts: from transcription factors to their target genes. Nutr Cancer. 54 (1), 69-78 (2006).
- Kim, S., et al. Aqueous extract of unripe Rubus coreanus fruit attenuates atherosclerosis by improving blood lipid profile and inhibiting NF-κB activation via phase II gene expression. J Ethnopharmacol. 146 (2), 515-524 (2013).
- Wang, J., Mazza, G. Effects of anthocyanins and other phenolic compounds on the production of tumor necrosis factor alpha in LPS/IFN-gamma-activated RAW 264.7 macrophages. J Agric Food Chem. 50 (15), 4183-4189 (2002).
- Pascual-Teresa, S., Moreno, D. A., Garcia-Viguera, C. Flavanols and anthocyanins in cardiovascular health: a review of current evidence. Int J Mol Sci. 11 (4), 1679-1703 (2010).
- Kim, D. O., Lee, C. Y. Extraction and Isolation of Polyphenolics. Curr Protoc Food Analyt Chem. 1, 2.1-2.12 (2002).
- Queires, L. C., et al. Polyphenols purified from the Brazilian aroeira plant (Schinus terebinthifolius, Raddi) induce apoptotic and autophagic cell death of DU145 cells. Anticancer Res. 26 (1A), 379-387 (2006).
- Griendling, K. K., Taubman, M. B., Akers, M., Mendlowitz, M., Alexander, R. W. Characterization of phosphatidylinositol-specific phospholipase C from cultured vascular smooth muscle cells. J Biol Chem. 266 (23), 15498-15504 (1991).
- Vuong, T., et al. Role of a polyphenol-enriched preparation on chemoprevention of mammary carcinoma through cancer stem cells and inflammatory pathways modulation. J Transl Med. 14, (2016).
