혈관 평활근 세포 치료를위한 동결 건조 베리 파우더에서 폴리 페놀 추출 및 정제<em> In Vitro</em
Summary
이 작품은 동결 건조 베리 파우더에서 폴리 페놀이 풍부한 추출물을 준비하는 단계별 방법을 자세히 설명합니다. 또한 Vascular Smooth Muscle Cells (VSMCs)를 사용하여 펩타이드 호르몬 인 안지오텐신 II (Ang II)의 존재하에 세포 배양에서 이들 폴리 페놀이 풍부한 추출물을 사용하는 방법에 대한 철저한 설명을 제공합니다.
Abstract
역학 조사에 따르면 플라보노이드 섭취가 증가하면 미국과 유럽에서 심혈관 질환 (CVD)으로 인한 사망률이 감소하는 것으로 나타났습니다. 딸기는 미국에서 광범위하게 소비되며 폴리 페놀 함량이 높습니다. 폴리 페놀은 많은 분자 표적과 상호 작용하고 항산화, 항염증제 및 심장 보호 효과를 비롯한 수많은 긍정적 인 생물학적 기능을 발휘하는 것으로 나타났습니다. 블랙 베리 (BL), 라즈베리 (RB) 및 블랙 라즈베리 (BRB)에서 분리 된 폴리 페놀은 안지오텐신 II (Ang II)에 대한 산화 스트레스와 세포 노화를 감소시킵니다. 이 작품은 동결 건조 딸기에서 폴리 페놀 추출물을 준비하는 데 사용되는 프로토콜에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 동결 건조 베리 분말로부터 폴리 페놀 추출을 80 % 수성 에탄올 및 초음파 보조 추출법을 사용하여 수행 하였다. 조 추출물을 추가로 정제하고 클로로포름 및 에틸 아세테이트를 사용하여 분획하고,각기. 원유 및 정제 추출물의 효과는 배양 된 혈관 평활근 세포 (VSMCs)에서 시험 하였다.
Introduction
폴리 페놀은 그 구조 중에 적어도 하나의 페놀 릭 고리를 함유하고 식물 왕국에 풍부하게 존재하는 화합물이다. 인간은 그러한 화합물의 존재를 의식하지 않고 약용 목적으로 수천 년 동안 식물을 먹고있다. 많은 과일과 채소에는 플라보노이드, 스틸 벤 (stilbenes), 페놀 릭산 (phenols acids) 3을 포함한 다양한 양의 폴리 페놀 화합물이 있습니다. 폴리 페놀은 다채로운 과일과 채소와 관련이 있지만 이는 사실이 아닙니다. 예를 들어, zeaxanthin과 xanthine은 양파와 마늘과 같이 매우 다채롭지 않은 채소에 존재하며, 이는 scallions 계열에서 비롯되며 수많은 건강상의 이점과 관련이 있습니다 4 . 폴리 페놀은 여러 가지 건강상의 효능과는 별도로 식물을 곤충에서 보호하여d 자외선 2 . 폴리 페놀은 일반적으로 인간의 식단에서 발견되며 반응성 산소 종 (ROS) 6 , 7 , 8을 제거 할 수 있기 때문에 강력한 항산화 물질로 간주됩니다. 그들은 또한 항염증제 9 , 항균제 10 , 항 고혈압제 11 및 항암제 12 , 13 성질이 있습니다.
역학 연구는 플라보노이드와 심혈관 질환 (CVD) 발병률 16 , 17 및 사망률 14 , 15 사이의 역 상관 관계를 보여줍니다. 딸기는 미국에서 널리 섭취되고 있으며 플라보노이드를 포함한 많은 양의 폴리 페놀을 함유하고 있습니다. 예를 들어, 블랙 베리 (BL) 주스 (300 mL / d)에서 8 주 동안 이상 지질 혈증 환자에서 수축기 혈압을 유의하게 감소시켰다. Jeong et al. 19 명은 하루에 2.5g의 블랙 라즈베리 (BRB) 추출물을 섭취 한 고혈압 남성과 여성이 위약을 복용 한 남성과 그렇지 않은 여성보다 하루 24 시간 낮고 혈압이 낮았다 고 전했다. 라스베리 (RB)는 혈압을 감소시키는 반면 자발적으로 고혈압 쥐에서 수퍼 옥사이드 디스 뮤타 아제 (SOD)의 발현을 증가시킨다. BL, RB 및 BRB가 혈관 평활근 세포 (VSMC)에서 안지오텐신 II (Ang II)에 의해 유도 된 ROS 및 노화의 수준을 감소 시킨다는 것이 최근에 밝혀졌습니다 21 . 또한 BL 추출물의 안토시아닌 분획물은 유도 성 질소 산화물 합성 효소 (iNOS)의 발현을 감소 시켰으며, LPS (lipopolysaccharide) 자극 된 핵 인자 Kappa B (NF-κB) 및 세포 외 신호 조절 키나아제 (ERK)의 활성을 억제 하였다. J774 세포ass = "xref"> 22. BRB 추출물 은 시험 관내 에서 NF-κB 활성화 및 cyclooxygenase 2 (COX-2) 발현 을 감소 시켰고, 지질 프로필을 향상 시켰으며, 고지 방식을 먹인 쥐에서 죽상 경화증 병변 형성을 막았다. 열매에서 가장 풍부한 플라 보 노이드로 여겨지는 안토시아닌은 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α) 생성을 감소시키고 VSMCs 26 의 증식과 이동을 감소시킴으로써 LPS- 자극 RAW 264.7 대식 세포에서 염증 반응을 조절한다.
인체 건강 및 질병에서 폴리 페놀의 역할을 이해하는 데 관심이 커지면서 추출 방법을 최적화하는 것이 중요합니다. 솔벤트 추출은 비용 효율적이고 쉽게 재현 할 수 있기 때문에 널리 사용됩니다. 이 연구에서는 에탄올과 함께 용매 추출물을 사용하였고, 초음파 보조 추출물n 방법으로, Kim과 Lee로부터 적응시켰다. 퀸 즈 (Queires) 등 28) 이 채택한 정제 추출물 (PE) 분획을 얻기 위해 클로로포름 및 에틸 아세테이트를 사용하여 조 추출물 (CE)의 정제 및 분별을 실시 하였다. 또한, BL의 정제 된 폴리 페놀 추출물 대 ERK1 / 2의 기초 인산화를 감소시키는 효능을 비교하였고, 정제 된 BL 폴리 페놀 추출물이 Ang II- 유도 된 VSMCs 신호 감소 억제 효과의 대표적인 예가 제공되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
딸기에서 단리 된 폴리 페놀은 별개의 조성물을 함유하고있다. 여기에 기술 된 에탄올 기반의 추출 프로토콜은 BL의 조잡하고 정제 된 폴리 페놀 추출물에 존재하는 페놀 릭 산과 플라보노이드의 서로 다른 수준의 확인을 허용했다 ( 표 1 ). CE는 갈산, 훼 루릴 산, 4-O- 카페인 퀴 닉산 및 5-O- 카페인 퀴 닉산으로 농축되었다. 정제 공정은 갈산 및 p- 쿠마린 산의 수준을 크게 변화시키지 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 미국 심장 협회 (14GRNT20180028)와 플로리다 주립 대학 연구 및 창의위원회 (COFRS)가 자금을 지원했습니다.
Materials
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich, Inc. | A9525-10MG | Treatment of VSMCs |
| β-actin | Sigma-Aldrich, Inc. | A2228 | Primary antibody (1:5000) |
| Blackberry fruit | Mercer Foods | Freeze-dried blackberry powder | |
| Catalase | Calbiochem | 219010 | Primary antibody (1:1000) |
| Chloroform | Biotech Grd, Inc. | 97064-678 | Preparation of purified polyphenol extracts |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-014-CV | Culture of VSMCs |
| Ethanol (absolute molecular biology grade) | Sigma-Aldrich, Inc. | E7023-500ML | Preparation of polyphenol extracts |
| Ethylacetate | Sigma-Aldrich, Inc. | 439169 | Preparation of purified polyphenol extracts |
| ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9102S | Primary antibody (1:500) |
| EDTA, 500 mM, pH 8.0 | Teknova, Inc. | E0306 | Lysis buffer |
| Freeze-Dryer | Labconco | VirTis Benchtop K | Preparation of polyphenol extracts |
| FBS | Seradigm | 1400-500 | Cell culture |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | Lysis buffer |
| NaCl | EMD Millipore, Inc. | 7760 | Lysis buffer |
| NaF | J.T.Baker, Inc. | 3688-01 | Lysis buffer |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, Inc. | 450243 | Lysis buffer |
| Na4P2O7 , decahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | S-9515 | Lysis buffer |
| phospho ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9101S | Primary antibody (1:1000) |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich, Inc. | P8340-5ml | Lysis buffer |
| Protein assay dye reagent | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 500-0006 | Protein concentration Measurement |
| PVDF transfer membrane | Thermo Scientific, Inc. | 88518 | Western blots |
| Rotatory Evaporator | Buchi Labortechnik | Rotavapor R3000 |
Preparation of polyphenol extracts |
| Sterile water | Mediatech, Inc. | 25-055-CV | Preparation of polyphenol extracts |
| Sonicator | QSonica, LLC | Q125 | Preparation of cell extracts |
| SOD2 | Enzo Life Sciences, Inc. | ADI-SOD-110-F | Primary antibody (1:1000) |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich, Inc. | X100 | Western blots |
| Whatman #2 filter paper | GE Healthcare, Inc. | 28317-241 | Preparation of polyphenol extracts |
References
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