血管平滑筋細胞の処理のための凍結乾燥ベリー粉末からのポリフェノールの抽出および精製<em>インビトロ</em
Summary
この作品は、凍結乾燥したベリーパウダーからポリフェノールが豊富な抽出物を調製するための段階的な方法を詳述しています。さらに、血管平滑筋細胞（VSMCs）を用いたペプチドホルモンアンギオテンシンII（Ang II）の存在下で、これらのポリフェノールに富む抽出物を細胞培養においてどのように使用するかについての完全な記述を提供する。
Abstract
疫学研究によると、フラボノイドの摂取量の増加は、米国および欧州における心血管疾患（CVD）による死亡率の減少と相関しています。ベリーは米国で広く消費されており、ポリフェノール含有量が高い。ポリフェノールは、多くの分子標的と相互作用し、抗酸化剤、抗炎症剤、および心臓保護作用を含む多くの陽性の生物学的機能を発揮することが示されている。ブラックベリー（BL）、ラズベリー（RB）およびブラックラズベリー（BRB）から単離されたポリフェノールは、アンジオテンシンII（Ang II）に応答する酸化ストレスおよび細胞老化を減少させる。この研究は、凍結乾燥果実からポリフェノール抽出物を調製するために使用されるプロトコルの詳細な説明を提供する。凍結乾燥したベリー粉末からのポリフェノール抽出は、80％水性エタノールおよび超音波補助抽出法を用いて行った。粗抽出物をさらに精製し、クロロホルムおよび酢酸エチルを用いて分画し、それぞれ、粗抽出物および精製抽出物の両方の効果を培養物中の血管平滑筋細胞（VSMC）で試験した。
Introduction
ポリフェノールは、その構造中に少なくとも1つのフェノール環を含む化合物であり、植物界1に多量に存在する。人間は、そのような化合物の存在を意識することなく、何千年もの薬用植物を摂取してきた2 。多くの果物と野菜には、フラボノイド、スチルベン、フェノール酸などの異なる量であるにもかかわらず、いくつかの共有ポリフェノール化合物があります。ポリフェノールはしばしばカラフルな果物や野菜と関連していますが、これは厳密には当てはまりません。例えば、ゼアキサンチンやキサンチンは、タマネギやニンニクなど、カリカリではない野菜に含まれています。これらは、スカリオンの家族に由来し、数多くの健康上の利点に関連しています4 。ポリフェノールは、いくつかの健康上の利益に関連するほか、植物を昆虫から保護して、d紫外線2 。ポリフェノールは人間の食生活によく見られ、反応性酸素種（ROS）6,7,8を取り除くことができるため、強力な抗酸化物質と考えられています。また、抗炎症剤9 、抗菌剤10 、抗高血圧剤11 、および抗発癌性12,13の特性を有する。
疫学研究は、フラボノイドの摂取と心血管疾患（CVD）の発生率16,17および死亡率14,15との間に逆相関があることを示している。ベリーは米国で広く消費されており、フラボノイドを含む多量のポリフェノールを含有している。例えば、ブラックベリー（BL）ジュース（300 mL / d）を8週間投与すると、異脂肪血症患者の収縮期血圧が有意に低下した18 。 Jeong ら 19人は、1日に2.5gのブラックラズベリー（BRB）抽出物を消費する高血圧前の男性および女性が、プラセボを摂取する人々と比較して、24時間および夜間の血圧が低いことを報告した。ラズベリー（RB）は血圧を低下させ、一方、自然発症高血圧ラットではスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）の発現を増加させる20 。最近、BL、RB、およびBRBは、血管平滑筋細胞（VSMC） 21におけるアンジオテンシンII（Ang II）によって誘導されるROSおよび老化のレベルを低下させることが示されている21 。さらに、BL抽出物からのアントシアニン画分は、誘導性酸化窒素シンターゼ（iNOS）の発現を減少させ、リポ多糖（LPS）刺激における核因子κB（NF-κB）および細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK）の活性を阻害したJ774細胞ass = "xref"> 22。 BRB抽出物は、高脂肪食餌を与えたマウスのNF-κB活性化およびシクロオキシゲナーゼ2（COX-2）発現をインビトロで低下させ、脂質プロファイルを改善し、アテローム性動脈硬化病変を形成しなかった24 。ベリーにおける最も豊富なフラボノイドと考えられているアントシアニンは、腫瘍壊死因子α（TNF-α）産生を低下させ、VSMCの増殖および遊走を減少させることにより、LPS刺激RAW 264.7マクロファージにおける炎症応答を調節する。
ヒトの健康と疾病におけるポリフェノールの役割を理解することへの関心が高まっているので、抽出方法を最適化することが重要である。溶媒抽出は、費用効果が高く容易に再現可能であるため、その目的で広く使用されている。この研究では、エタノールを用いて溶媒抽出を行い、超音波補助抽出物この方法は、KimとLeeの手法を応用したものである27 。クロロホルムおよび酢酸エチルを用いる粗抽出物（CE）の精製および分画を実施して、Queires ら 28から適合された精製抽出物（PE）画分を得た。さらに、BL由来の精製されたポリフェノール抽出物とERK1 / 2の基礎的なリン酸化を減少させるBLの精製されたポリフェノール抽出物との効果を比較し、精製されたBLポリフェノール抽出物のAng II誘発性VSMCsの抑制効果の代表例を提供した。
Protocol
Representative Results
Discussion
ベリーから単離されたポリフェノールは、明確な組成物を含有する。本明細書に記載のエタノールベースの抽出プロトコールは、BLの粗製および精製ポリフェノール抽出物中に存在する種々のレベルのフェノール酸およびフラボノイドの同定を可能にした（ 表1 ）。 CEは没食子酸、フェルラ酸、4-O-カフェオイルキナ酸、5-O-カフェオイルキナ酸に富んだ。精製プロセスは、没食子?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、米国心臓協会（14GRNT20180028）およびフロリダ州立大学研究および創造性評議会（COFRS）によって資金提供を受けた。
Materials
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich, Inc. | A9525-10MG | Treatment of VSMCs |
| β-actin | Sigma-Aldrich, Inc. | A2228 | Primary antibody (1:5000) |
| Blackberry fruit | Mercer Foods | Freeze-dried blackberry powder | |
| Catalase | Calbiochem | 219010 | Primary antibody (1:1000) |
| Chloroform | Biotech Grd, Inc. | 97064-678 | Preparation of purified polyphenol extracts |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-014-CV | Culture of VSMCs |
| Ethanol (absolute molecular biology grade) | Sigma-Aldrich, Inc. | E7023-500ML | Preparation of polyphenol extracts |
| Ethylacetate | Sigma-Aldrich, Inc. | 439169 | Preparation of purified polyphenol extracts |
| ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9102S | Primary antibody (1:500) |
| EDTA, 500 mM, pH 8.0 | Teknova, Inc. | E0306 | Lysis buffer |
| Freeze-Dryer | Labconco | VirTis Benchtop K | Preparation of polyphenol extracts |
| FBS | Seradigm | 1400-500 | Cell culture |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | Lysis buffer |
| NaCl | EMD Millipore, Inc. | 7760 | Lysis buffer |
| NaF | J.T.Baker, Inc. | 3688-01 | Lysis buffer |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, Inc. | 450243 | Lysis buffer |
| Na4P2O7 , decahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | S-9515 | Lysis buffer |
| phospho ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9101S | Primary antibody (1:1000) |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich, Inc. | P8340-5ml | Lysis buffer |
| Protein assay dye reagent | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 500-0006 | Protein concentration Measurement |
| PVDF transfer membrane | Thermo Scientific, Inc. | 88518 | Western blots |
| Rotatory Evaporator | Buchi Labortechnik | Rotavapor R3000 |
Preparation of polyphenol extracts |
| Sterile water | Mediatech, Inc. | 25-055-CV | Preparation of polyphenol extracts |
| Sonicator | QSonica, LLC | Q125 | Preparation of cell extracts |
| SOD2 | Enzo Life Sciences, Inc. | ADI-SOD-110-F | Primary antibody (1:1000) |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich, Inc. | X100 | Western blots |
| Whatman #2 filter paper | GE Healthcare, Inc. | 28317-241 | Preparation of polyphenol extracts |
References
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