دقة الخلوية طريقة الاجتثاث لنمذجة إصابة الكلى الحادة في تطوير الزرد
Summary
يعرض هذا العمل الجديد في نموذج الجسم الحي من إصابة الكلى القطعي باستخدام الكلى غفب المعدلة وراثيا الزرد. نموذج يسمح لتحريض الاجتثاث المستهدفة من الخلايا الظهارية الكلى لإظهار الآليات الخلوية للإصابة نيفرون وإصلاح.
Abstract
إصابة الكلى الحاد (أكي) هو حالة طبية شائعة مع ارتفاع معدل الوفيات. مع قدرات إصلاح الكلى، فمن الممكن لاستعادة وظائف الكلى الكافية بعد العلاج الداعم. ومع ذلك، هناك حاجة إلى فهم أفضل لكيفية موت الخلايا نيفرون وإصلاح على المستوى الخلوي للحد من موت الخلايا وتعزيز عملية التجدد. و برونيفروس الزرد هو نظام نموذج جيد لتحقيق هذا الهدف لأنه يحتوي على شرائح التشريحية التي تشبه نفرون الثدييات. في السابق، كان النموذج الأكثر شيوعا لدراسة إصابة الكلى في الأسماك نموذج جنتاميسين الدوائية. ومع ذلك، فإن هذا النموذج لا يسمح للسيطرة الزمانية الزمانية دقيقة من الإصابة، وبالتالي فمن الصعب دراسة العمليات الخلوية والجزيئية المعنية في إصلاح الكلى. للتغلب على هذا القيد، يعرض هذا العمل طريقة يمكن من خلالها، على النقيض من النهج جنتاميسين، بروتين أخضر فوريسنت محددة (غفب) -exوالضغط على جزء نيفرون يمكن تصويرها باستخدام ضوء الليزر البنفسجي (405 نانومتر). هذا النموذج الرواية من أكي يوفر العديد من المزايا التي أساليب أخرى من الإصابة الظهارية تفتقر. مزاياه الرئيسية هي القدرة على "الاتصال الهاتفي" مستوى الإصابة والتحكم الزماني الزماني الدقيق في قوية في نموذج الحيوان الحي . هذه الطريقة الجديدة لديها القدرة على تحقيق تقدم كبير في مستوى فهم إصابات الكلى وآليات إصلاح.
Introduction
إصابة الكلى الحادة (أكي) 1 ، 2 ، والتي يمكن أيضا أن يشار إليها بالفشل الكلوي الحاد، يتم تعريفها على نطاق واسع بأنها ضعف مفاجئ في وظائف الكلى 3 . في حين أن مستوى فهم هذا الشرط قد تعزز بشكل ملحوظ على مر السنين، ظلت معدلات الاعتلال والوفيات مرتفعة 1 ، 2 . العلاج الحالي لهذه الحالة هو في الغالب داعمة، كما كانت نتيجة التجارب السريرية متعددة من العلاج بالعقاقير السلبية 4 ، 5 . الكلى هي فريدة من نوعها في أن لديها القدرة على إصلاح نفسها. لذلك، العلاج الداعم بعد التشخيص المبكر لل أكي هو أفضل وسيلة للحد من الاعتلال 6 . ومع ذلك، فإنه من الصعب الكشف عن أكي في وقت مبكر، ومعدل الوفيات هو مذهل 50-80٪ لأولئك الذين يحتاجون إلى غسيل الكلى 5. مع قدرة الكلى على إصلاح أنفسهم وعدم وجود خيارات العلاج لهذا الشرط، فمن المهم لتطوير أساليب لتعزيز هذه العملية تجديد نيفرون.
كانت هناك العديد من النماذج المختلفة المستخدمة لأبحاث أكي التي تشمل عوامل مختلفة للإصابة والنماذج الحيوانية. من حيث وكلاء تلف الكلى، وقد استخدم جينتاميسين المضادات الحيوية أمينوغليكوزيد كعامل كلوي يؤدي إلى أكي 7 ، 8 . ومع ذلك، وجدت عدة مجموعات أن العلاج الجنتاميسين هو قاتلة إلى الجنين الزرد 9 . أنه يسبب الضرر أنبوبي الذي هو خطير جدا لاستعادة الجنين، مما يجعل دراسة تجديد صعبة من دون نوع من التدخل. وتعتبر نماذج الثدييات، مثل الفئران والفئران، قيمة أيضا، ولكنها تواجه العديد من القيود أثناء دراسة أكي. ولعل العيب الرئيسي لنماذج القوارض هو صعوبة فيسواليزينغ الكلى القوارض وبالتالي تحديد العمليات المكانية الزمانية دقيقة مما يؤدي إلى الموت الظهاري وإصلاح.
جونسون وآخرون. قد ذكرت تقنية القائم على التذرية الليزر للحث على إصابة الكلى الحادة في الزرد الجنينية واليرقات 9 . واستخدموا التذرية الليزر نابض لتلف الكلى بعد الحقن العضلي مع تقارن ديكستران. مضان من يقارن ديكستران يسمح لتصور الضرر وتجديد في ظهارة نبيب 9 . هذا النموذج يتغلب على اثنين من القيود المذكورة أعلاه، لكنه لا يسمح لمستويات متدرجة من الاصابة ويصعب القيام بها على مجموعات الخلايا التعسفية الكبيرة.
نموذج الزرد القائم على الاجتثاث الليزر الجديد من أكي وصفها هنا يتناول كل القيود المذكورة أعلاه. إن الكلى الليمونية في الزرد اليرقي هي ناضجة، وهي الجهاز الذي يحتوي على شرائح مشابهة للثدييات نفرون، بما في ذلك الكبيبات، والأنابيب القريبة والقاصية، وقناة تجميع 10 . اليرقات الزرد هي أيضا شفافة بصريا، مما يجعل من الممكن لمراقبة الكلى من خلال تقنيات مضان. وهكذا، الزرد هي قيمة في نموذج الجسم الحي من أكي، والكلى اليرقات الليمون (5-12 يوما بعد التسميد (دبف) يمكن استخدامها لدراسة العمليات الخلوية والجزيئية المعنية في إصابة الكلى وإصلاح.
تعرض هذه الورقة طريقة يمكن من خلالها تصوير بروتينات الفلورسنت الأخضر (غفب) محددة، بقطع نفرون باستخدام طاقة منخفضة (بالمقارنة مع نظام ليزر نابض) ضوء الليزر البنفسجي (405 نانومتر). و غفب مضان يسمح لاستهداف مجموعة من الخلايا، مما يجعل التغييرات التي تحدث مرئية من خلال مراقبة فوتوبلاشينغ غفب. وبالإضافة إلى ذلك، غفب (عن طريق امتصاص الضوء البنفسجي) بمثابة بالوعة الطاقة لتحفيز الإصابة في غفب معربا عن خلايا الكلى. الفاصل الزمني الفاصل بين الوقتثم يمكن استخدام نسخة لدراسة عملية الإصلاح. وقد وجدت الدراسات تكاثر الخلايا، وهجرة الخلايا، وحؤول الخلايا 11 ، 12 ، 13 إلى أن تكون العمليات المحتملة التي قد تلعب دورا هاما في إصلاح الكلى. ومع ذلك، فإن الأهمية النسبية لهذه العمليات وتفاصيل تفاعلها كان من الصعب كشف بسبب القيود المفروضة على النماذج الحالية من أكي. باستخدام هذا النهج الرواية، كان من الممكن أن تظهر أن الهجرة الخلية تلعب دورا رئيسيا في إصلاح الكلى بعد إصابة حادة 14 .
Protocol
Representative Results
Discussion
وتجدر الإشارة إلى أن قوة الليزر الإجمالية تختلف بين النظم. ومع ذلك، باستخدام النسبة المئوية غفب فوتوبلاشينغ يسمح لقراءة من إجمالي الطاقة تسليمها إلى الكلى الفلورسنت، مستقلة عن الاختلاف في قوة الليزر وتعويض عن طول التعرض. نضع في اعتبارنا، ومع ذلك، أن استجابة الأنسجة…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر الدكتور إيان دروموند والدكتور فلاديمير كورز لتقاسم خطوط غفب الكلى المعدلة وراثيا. ونود أيضا أن نشكر نيتكوم على توفير الموارد اللازمة للقيام بهذا العمل. تم دعم هذه الدراسة جزئيا من المنح: K08DK082782، R03DK097443 (نيه)، والمنحة التجريبية هسي (أف).
Materials
| Petri Dishes, 35 x 10mm | Genesee Scientific | 32-103 | Procedural Usage: Step 2.4,2.7 |
| Petri Dishes, 100 x 15mm | Midwest Scientific | 910 | Procedural Usage: Step 1 |
| De-chorination forceps- Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar | Fischer Scientific | 50-241-57 | Procedural Usage: Step 2.1.1 |
| Plastic Transfer Pipet | Globe Scientific | 135030 | Procedural Usage: Step 2.5, 3.6 |
| Tricaine | Sigma Aldrich | A5040-25G | Procedural Usage: Step 2.3, 3.4 |
| Agarose | Fischer Scientific | BP165-25 | Procedural Usage: Step 2.3 |
| Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes) | Fischer Scientific | 21-1640-2C | Procedural Usage: Step 2.4 |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | Procedural Usage: Step 1.5 |
| SOLA Light Engine | Lumencor | SOLA SM-5-LCR-SB | Procedural Usage: Step 1.5 |
| Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System | Nikon | Procedural Usage: Step 3 | |
| 1x E3 Solution | Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl 2 , 0.33 mM MgSO 4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3 | ||
| PTU | Sigma | P7629-10G | Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, and 4.2 |
| NIS Elements Software | Nikon | C2+ | Procedural Usage: Step 3 |
| Laser Unit | Agilent | MLC 400 | Procedural Step 3.11 |
| Propidium Iodide | Sigma Aldrich | P4170-100MG | Procedural Step Usage: 4.2 |
References
- Chertow, G. M. Acute Kidney Injury, Mortality, Length of Stay, And Costs In Hospitalized Patients. J Am Soc Nephrol. 16 (11), 3365-3370 (2005).
- Yasuda, H., et al. Incidence And Clinical Outcomes of Acute Kidney Injury Requiring Renal Replacement Therapy In Japan. Ther Apher Dial. 14 (6), 541-546 (2010).
- Waikar, S. S., Liu, K. D., Chertow, G. M. Diagnosis, Epidemiology And Outcomes of Acute Kidney Injury. Clin J Am Soc Nephrol. 3 (3), 844-861 (2008).
- Lameire, N., Van Biesen, W., Vanholder, R. Acute Kidney Injury. The Lancet. 372 (9653), 1863-1865 (2008).
- Esson, M. L. Diagnosis And Treatment of Acute Tubular Necrosis. Ann Intern Med. 137 (9), 744 (2002).
- Vaidya, V. S., Ferguson, M. A., Bonventre, J. V. Biomarkers of Acute Kidney Injury. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48 (1), 463-493 (2008).
- Hentschel, D. M. Acute Renal Failure In Zebrafish: A Novel System To Study A Complex Disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).
- Cianciolo Cosentino, C., et al. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae To Study Acute Kidney Injury. J Vis Exp. (42), (2010).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser Ablation of The Zebrafish Pronephros To Study Renal Epithelial Regeneration. J Vis Exp. (54), (2011).
- Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish Kidney Development. Methods Cell Biol. , 233-260 (2010).
- Toback, F. G. Regeneration After Acute Tubular Necrosis. Kidney Int. 41 (1), 226-246 (1992).
- Witzgall, R., et al. Localization of Proliferating Cell Nuclear Antigen, Vimentin, C-Fos, And Clusterin In The Postischemic Kidney. Evidence For A Heterogenous Genetic Response Among Nephron Segments, And A Large Pool of Mitotically Active And Dedifferentiated Cells. J Clin Invest. 93 (5), 2175-2188 (1994).
- Bonventre, J. V. Dedifferentiation And Proliferation of Surviving Epithelial Cells In Acute Renal Failure. J Am Soc Nephrol. 14 (90001), (2003).
- Palmyre, A., et al. Collective Epithelial Migration Drives Kidney Repair After Acute Injury. PLoS ONE. 9 (7), e101304 (2014).
- Vasilyev, A., Drummond, I. A. Live Imaging Kidney Development In Zebrafish. Methods Mol Biol. , 55-70 (2012).
- Korzh, V., et al. Visualizing Compound Transgenic Zebrafish In Development: A Tale of Green Fluorescent Protein And Killerred . Zebrafish. 8 (1), 23-29 (2011).
- Bollig, F., Mehringer, R., Perner, B., et al. Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish. Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).
- Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).
- Diep, C. Q., Ma, D., Deo, R. C., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebra fish. Am J Physiol. 299 (5), F1040-F1047 (2010).
- Fisher, S., Grice, E. A., Vinton, R. M., Bessling, S. L., McCallion, A. S. Conservation of RET regulatory function from human to zebrafish without sequence similarity. Science. 312 (5771), 276-279 (2006).
- Seiler, C., Pack, M. Transgenic labeling of the zebrafish pronephric duct and tubules using a promoter from the enpep gene. Gene Expr Patterns. 11, 118-121 (2011).
- Lin, H. F., Traver, D., Zhu, H., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).
- Choo, B. G., Kondrichin, I., Parinov, S., et al. Zebrafish transgenic Enhancer TRAP line database (ZETRAP). BMC Dev Biol. 6 (1), 5 (2006).
- Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo. Dev Dyn. 231 (2), 449-459 (2004).
