שיטה All-on- שבב עבור ניתוח נויטרופילי מהיר Chemotaxis ישירות מתוך ירידה של דם
Summary
מאמר זה מספק את השיטה המפורטת של ביצוע assay chemotaxis נויטרופילי מהיר על ידי שילוב של בידוד שבב נויטרופילי מן הדם כולו ואת הבדיקה chemotaxis על שבב microfluidic יחיד.
Abstract
הגירה נויטרופילי chemotaxis הם קריטיים עבור המערכת החיסונית של הגוף שלנו. מכשירים Microfluidic משמשים יותר ויותר לחקר נדידת נויטרופילים chemotaxis בשל היתרונות שלהם להדמיה בזמן אמת, שליטה מדויקת של ריכוז כימי הדרגתיות הדרגתית, מופחתת מגיב וצריכה מדגם. לאחרונה, מאמץ גדל והולך נעשה על ידי חוקרים microfluidic לעבר פיתוח משולב ופעל בקלות microfluidic chemotaxis ניתוח מערכות, ישירות מכל הדם. בכיוון זה, שיטת All-on-chip הראשונה פותחה עבור שילוב הטיהור השלילי המגנטי של נויטרופילים ואת assay chemotaxis מדגימות נפח דם קטן. שיטה חדשה זו מאפשרת מהירה דגימה אל נויטרופיל הבדיקה chemotaxis הבדיקה ב 25 דקות. במאמר זה, אנו מספקים בנייה מפורטת, ניתוח שיטת ניתוח נתונים עבור assay זה כל שבב chemotaxis assay עם דיון על אסטרטגיות לפתרון בעיות, limiציורים וכיוונים עתידיים. תוצאות נציג של assay chemotaxis נויטרופילי בדיקות chemoattractant מוגדר, N -Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), ואת כיח מחולה מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), תוך שימוש בשיטה זו על כל שבב מוצגים. שיטה זו חלה על חקירות רבות הקשורות להעברת תאים ויישומים קליניים.
Introduction
Chemotaxis, תהליך של הגירה תא מכוון לשיכוך מסיס ריכוז כימי, הוא מעורב באופן קריטי בתהליכים ביולוגיים רבים כולל תגובה חיסונית 1 , 2 , 3 , פיתוח רקמות 4 וגרורות סרטן 5 . נויטרופילים הם תת-הדם השופע ביותר בתאי הדם הלבנים וממלאים תפקידים מכריעים בהפיכת פונקציות ההגנה המארחת של הגוף, כמו גם בתיווך של תגובות חיסוניות אדפטטיביות 6 , 7 . נויטרופילים מצוידים במנגנון chemotactic מוסדר מאוד המאפשר לתאי החיסון המווסתים להגיב לתאי chemoattractants שמקורם בפאתוגן ( למשל fMLP) ומנגנוני chemoattractants ( לדוגמה אינטרלוקין 8). הגירה נויטרופילי chemotaxis לתווך בעיות פיזיולוגיות שונותומחלות כגון דלקת וסרטן 1 , 9 . לפיכך, הערכה מדויקת של chemotaxis נויטרופילי מספק readout תפקודית חשובה לחקר הביולוגיה נויטרופילי מחלות הקשורות.
לעומת מבחני chemotaxis קונבנציונאלי בשימוש נרחב ( למשל assay transwell 10 ), התקנים microfluidic להראות הבטחה גדולה להערכה כמותית של נדידת תאים chemotaxis בשל הדור מדוייק כימית מדויק הדור מזעור 11 , 12 , 13 . במהלך שני העשורים האחרונים או כך, מכשירים microfluidic שונים פותחו כדי לחקור את chemotaxis של סוגי תאים ביולוגיים שונים, במיוחד נויטרופילים 11 . מאמץ משמעותי הוקדש לאפיון הגירה נויטרופילים ב-ספטיוטומפוראלי מדרגיות mical שהוגדרו התקנים microfluidic 14 , 15 . אסטרטגיות מעניינות פותחו גם כדי ללמוד החלטות כיוונית על ידי נויטרופילים באמצעות מכשירים microfluidic 16. מלבד מחקר ביולוגי, היישומים של התקנים microfluidic הורחבו לבחון דגימות קליניות להערכת המחלה 17 , 18 , 19 . עם זאת, השימוש במכשירים microfluidic רבים מוגבל מעבדות מחקר מיוחד דורש בידוד נויטרופילי ארוך מנפח גדול של דגימות דם. לכן, חלה מגמה הולכת וגדלה של פיתוח מכשירים משולבים microfluidic עבור ניתוח chemotaxis נויטרופילי מהיר ישירות טיפה של דם שלם 20 , 21 , 22 ,Ef "> 23 , 24 .
לכיוון זה, שיטת All-on-chip פותחה המשלבת את הטיהור נויטרופילי המגנטי שלילי ואת assay chemotaxis הבאים על מכשיר microfluidic יחיד 25 . שיטה זו על כל שבב יש את התכונות הרומן הבא: 1) בניגוד אסטרטגיות שבב הקודם לבודד נויטרופילים מן הדם על ידי הידבקות תא מבוסס הדבקה או גודל התא מבוסס סינון 20 , 22 , שיטה חדשה זו מאפשרת גבוהה טוהר, על שבב הפרדה מגנטית של נויטרופילים מ כרכים קטנים של דם שלם, כמו גם מדידה chemotaxis על גירוי chemoattractant; 2) מבנה עגינה התא מסייע ליישר את העמדות הראשוניות של נויטרופילים קרוב לתעלה כיוונית כימיים ומאפשר ניתוח chemotaxis פשוטה ללא מעקב תא יחיד; 3) שילוב של בידוד נויטרופילי וכימותAssay ציר על מכשיר microfluidic יחיד מאפשר מהיר מדגם ניתוח ניתוח chemotaxis ב 25 דקות, כאשר אין הפרעה בין צעדים ניסיוניים.
מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט עבור הבנייה, ניתוח שיטת ניתוח נתונים של assay זה על שבב chemotaxis assay. המאמר מדגים את השימוש היעיל בשיטה שפותחה עבור ביצוע chemotaxis נויטרופילי על ידי בדיקת chemoattractant רקומביננטי ידוע דגימות chemotactic מורכבים מהחולים, ואחריו דיון על אסטרטגיות פתרון בעיות, מגבלות וכיוונים עתידיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה, פרוטוקול מפורט לבודד ישירות נויטרופילים מן הדם כולו ואחריו הבדיקה chemotaxis, על כל שבב microfluidic, תוארה. שיטה זו מציעה תכונות שימושיות בתפעול קל שלה, בחירה שלילית של נויטרופילים טוהר גבוהה, מדגם מהיר ל-תוצאה הבדיקה chemotaxis, ריאגנטים מופחת וצריכה מדגם, מדויק ניתוח נתו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי מענקים של מדעי הטבע והנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC) ואת המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR). אנו מודים למכון הקליני למחקר יישומי וחינוך בבית החולים הכללי "ויקטוריה" בוויניפג ובבית החולים הכללי "סבן אוקס" בוויניפג על ניהול דגימות קליניות של בני אדם. אנו מודים לד"ר חגית פרץ-סורוקה על דיון מועיל באסטרטגיות הפעולה של אסאי. אנו מודים לפרופסור קרולין רן וד"ר קסיאומינג (קודי) צ'ן מאוניברסיטת ווטרלו על תמיכתם הנדיבה בתהליך הצילומים.
Materials
| Device fabrication | |||
| Mask aligner | ABM | N/A | |
| Spinner | Solitec | 5000 | |
| Hotplate | VWR | 11301-022 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Vacuum dessicator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
| Digital scale | Ohaus | CS200 | |
| SU-8 2000 thinner | Microchem | SU-8 2000 | |
| SU-8 2025 photoresist | Microchem | SU-8 2025 | |
| SU-8 developer | Microchem | SU-8 developer | |
| Si wafer | Silicon, Inc | LG2065 | |
| isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-4 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane | Gelest | 78560-45-9 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) |
Ellsworth Adhesives | 2065622 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Cutting pad | N/A | N/A | Custom-made |
| Punchers | N/A | N/A | Custom-made |
| Name | Source | Catalog Number | Comments |
| On-chip cell isolation and chemotaxis assay | |||
| RPMI 1640 | Fisher Scientific | SH3025502 | |
| DPBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Bovine serum albumin (BSA) |
Sigma-Aldrich | SH3057402 | |
| Fibronectin | VWR | CACB356008 | |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
| Magnetic disks | Indigo Instruments | 44202-1 | 5 mm in diameter, 1 mm thick |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD10S | |
| Rhodamine | Sigma-Aldrich |
R4127-5G | |
| Giemsa stain solution | Rowley Biochemical Inc. | G-472-1-8OZ | |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit |
STEMCELL Technologies Inc |
19666 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope | Nikon | Ti-U | |
| Microscope environmental chamber. | InVivo Scientific | N/A | |
| CCD camera | Nikon | DS-Fi1 |
References
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (13), 159-175 (2013).
- Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat Immunol. 6 (12), 1182-1190 (2005).
- Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).
- Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease. Cell. 132 (4), 612-630 (2008).
- Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).
- Kruger, P., et al. Neutrophils: between host defence, immune modulation, and tissue injury. PLoS Pathog. 11 (3), e1004651 (2015).
- Mócsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. J Exp Med. 210 (7), 1283-1299 (2013).
- Foxman, E. F., Campbell, J. J., Butcher, E. C. Multistep navigation and the combinatorial control of leukocyte chemotaxis. J Cell Biol. 139 (7), 1349-1360 (1997).
- Tazzyman, S., Niaz, H., Murdoch, C. Neutrophil-mediated tumour angiogenesis: subversion of immune responses to promote tumour growth. Semin Cancer Biol. 23 (3), 149-158 (2013).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115 (3), 453-466 (1962).
- Wu, J., Wu, X., Lin, F. Recent developments in microfluidics-based chemotaxis studies. Lab Chip. 13 (13), 2484-2499 (2013).
- Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).
- Kim, S., Kim, H. J., Jeon, N. L. Biological applications of microfluidic gradient devices. Integr Biol. 2 (11-12), 584-603 (2010).
- Irimia, D., et al. Microfluidic system for measuring neutrophil migratory responses to fast switches of chemical gradients. Lab Chip. 6 (2), 191-198 (2006).
- Lin, F., et al. Neutrophil migration in opposing chemoattractant gradients using microfluidic chemotaxis devices. Ann Biomed Eng. 33 (4), 475-482 (2005).
- Ambravaneswaran, V., Wong, I. Y., Aranyosi, A. J., Toner, M., Irimia, D. Directional decisions during neutrophil chemotaxis inside bifurcating channels. Integr Biol. 2 (11-12), 639-647 (2010).
- Jones, C. N., et al. Spontaneous neutrophil migration patterns during sepsis after major burns. PloS One. 9 (12), e114509 (2014).
- Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS One. 5 (7), e11921 (2010).
- Wu, J., et al. A microfluidic platform for evaluating neutrophil chemotaxis induced by sputum from COPD patients. PloS One. 10 (5), e0126523 (2015).
- Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120 (14), e45-e53 (2012).
- Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab Chip. 8 (12), 2054-2061 (2008).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic platform for measuring neutrophil chemotaxis from unprocessed human whole blood. J Vis Exp. (88), (2014).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic assay for precise measurements of mouse, rat, and human neutrophil chemotaxis in whole-blood droplets. J Leukocyte Biol. 100 (1), 241-247 (2016).
- Sackmann, E. K. -. H., et al. Characterizing asthma from a drop of blood using neutrophil chemotaxis. P Natl Acad Sci. 111 (16), 5813-5818 (2014).
- Wu, J., et al. An all-on-chip method for testing neutrophil chemotaxis induced by fMLP and COPD patient’s sputum. Technology. 04 (02), 104-109 (2016).
