הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שיטה All-on- שבב עבור ניתוח נויטרופילי מהיר Chemotaxis ישירות מתוך ירידה של דם

16.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55615

⸱

23 ביוני 2017

 ,  ,  ,  ,  , 

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מספק את השיטה המפורטת של ביצוע assay chemotaxis נויטרופילי מהיר על ידי שילוב של בידוד שבב נויטרופילי מן הדם כולו ואת הבדיקה chemotaxis על שבב microfluidic יחיד.

תקציר

הגירה נויטרופילי chemotaxis הם קריטיים עבור המערכת החיסונית של הגוף שלנו. מכשירים Microfluidic משמשים יותר ויותר לחקר נדידת נויטרופילים chemotaxis בשל היתרונות שלהם להדמיה בזמן אמת, שליטה מדויקת של ריכוז כימי הדרגתיות הדרגתית, מופחתת מגיב וצריכה מדגם. לאחרונה, מאמץ גדל והולך נעשה על ידי חוקרים microfluidic לעבר פיתוח משולב ופעל בקלות microfluidic chemotaxis ניתוח מערכות, ישירות מכל הדם. בכיוון זה, שיטת All-on-chip הראשונה פותחה עבור שילוב הטיהור השלילי המגנטי של נויטרופילים ואת assay chemotaxis מדגימות נפח דם קטן. שיטה חדשה זו מאפשרת מהירה דגימה אל נויטרופיל הבדיקה chemotaxis הבדיקה ב 25 דקות. במאמר זה, אנו מספקים בנייה מפורטת, ניתוח שיטת ניתוח נתונים עבור assay זה כל שבב chemotaxis assay עם דיון על אסטרטגיות לפתרון בעיות, limiציורים וכיוונים עתידיים. תוצאות נציג של assay chemotaxis נויטרופילי בדיקות chemoattractant מוגדר, N -Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), ואת כיח מחולה מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), תוך שימוש בשיטה זו על כל שבב מוצגים. שיטה זו חלה על חקירות רבות הקשורות להעברת תאים ויישומים קליניים.

מבוא

Chemotaxis, תהליך של הגירה תא מכוון לשיכוך מסיס ריכוז כימי, הוא מעורב באופן קריטי בתהליכים ביולוגיים רבים כולל תגובה חיסונית 1 , 2 , 3 , פיתוח רקמות 4 וגרורות סרטן 5 . נויטרופילים הם תת-הדם השופע ביותר בתאי הדם הלבנים וממלאים תפקידים מכריעים בהפיכת פונקציות ההגנה המארחת של הגוף, כמו גם בתיווך של תגובות חיסוניות אדפטטיביות 6 , 7 . נויטרופילים מצוידים במנגנון chemotactic מוסדר מאוד המאפשר לתאי החיסון המווסתים להגיב לתאי chemoattract....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל פרוטוקולי איסוף המדגם של בני האדם אושרו על ידי מועצת המחקר המשותפת של הפקולטה למחקרי מחקר באוניברסיטת מאניטובה, ויניפג.

1. ייצור מכשיר Microfluidic ( איור 1 א )

  1. מסכת עיצוב ושקיפות הדפסה.
    1. עיצבו את המכשיר כמפורט לעיל. ראה איור 1 א .
      הערה: ההתקן כולל שתי שכבות. השכבה הראשונה (4 מיקרומטר גבוה) מגדיר את....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

נויטרופילים נבחרים באופן שלילי מתוך ירידה של דם שלם ישירות במכשיר microfluidic. טוהר של נויטרופילים מבודדים אומת על ידי שבב Giemsa על השבב ואת התוצאות הראו את בצורת טבעת בצורת גרעין בצורת גרעין של נויטרופילים ( איור 2 א ) 25 . זה מצביע על בידוד יעיל על שבב נויטרופילי בטוהר גבוה מנפח קטן של דם שלם. יתר על כן, מבנה עגינה יכול ליישר ביעילות תאים ליד ערוץ הדרגתי לפני החלת שיפוע כימי (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במאמר זה, פרוטוקול מפורט לבודד ישירות נויטרופילים מן הדם כולו ואחריו הבדיקה chemotaxis, על כל שבב microfluidic, תוארה. שיטה זו מציעה תכונות שימושיות בתפעול קל שלה, בחירה שלילית של נויטרופילים טוהר גבוהה, מדגם מהיר ל-תוצאה הבדיקה chemotaxis, ריאגנטים מופחת וצריכה מדגם, מדויק ניתוח נתוני הגירה תא. כאומדן גס, לפחות 25% של נויטרופילים מן הדגימה כל הדם נכנס ביעילות את מבנה עגינה במכשיר מצאנו שטוהר נויטרופילי גבוה על ידי מכתים Giemsa על שבב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי מענקים של מדעי הטבע והנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC) ואת המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR). אנו מודים למכון הקליני למחקר יישומי וחינוך בבית החולים הכללי "ויקטוריה" בוויניפג ובבית החולים הכללי "סבן אוקס" בוויניפג על ניהול דגימות קליניות של בני אדם. אנו מודים לד"ר חגית פרץ-סורוקה על דיון מועיל באסטרטגיות הפעולה של אסאי. אנו מודים לפרופסור קרולין רן וד"ר קסיאומינג (קודי) צ'ן מאוניברסיטת ווטרלו על תמיכתם הנדיבה בתהליך הצילומים.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ייצור מכשיר
יישור מסכהABMN/A
SpinnerSolitec5000
HotplateVWR11301-022
מנקה פלזמהHarrick PlasmaPDC-001
מייבש ואקוםפישר סיינטיפיק08-594-15A
משקל דיגיטליOhausCS200
SU-8 2000 דק יותרMicrochemSU-8 2000
SU-8 2025 PhotoresistMicrochemSU-8 2025
SU-8 מפתחMicrochemSU-8 מפתח
Si waferSilicon, IncLG2065
איזופרופיל אלכוהולפישר סיינטיפיקA416-4
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilaneGelest78560-45-9
Polydimethylsiloxane
(PDMS)
Ellsworth Adhesives2065622
Petri DishFisher ScientificFB0875714
זכוכית שקופיות FisherScientific12-544-4
משטח חיתוךN/AN/Aבהתאמה אישית
פאנצ'ריםN/AN/A מותאם אישית
שםSourceCatalog NumberComments
>on-chip cell isolation and chemotaxis assay
RPMI 1640Fisher ScientificSH3025502
DPBSFisher ScientificSH3002802
בקר סרום אלבומין
(BSA)
סיגמא-אולדריץ'SH3057402
פיברונקטיןVWRCACB356008
fMLPSigma-AldrichF3506-10MG
דיסקים מגנטייםIndigo Instruments44202-1בקוטר 5 מ"מ, עובי

1 מ"מFITC-Dextran
Sigma-AldrichFD10S
Rhodamine
Sigma-Aldrich
R4127-5G
Giemsa תמיסת כתמיםRowley Biochemical Inc.G-472-1-8OZ
EasySep Direct Human
Neutrophil Isolation
ערכת
STEMCELL
Technologies Inc
19666
DithiothreitolSigma-AldrichD0632
Nikon Ti-U מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוךתא סביבתי מיקרוסקופ NikonTi-U
.מצלמת InVivo ScientificN/A
CCDNikonDS-Fi1

מקורות

  1. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (13), 159-175 (2013).
  2. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat Immun....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

התקן מיקרופלואידיבידוד מגנטי של נויטרופיליםבדיקת כימוטקסיסניתוח דם מלאהכנת התקן PDMSמדרג כימו-אטרקטוריםניתוח נדידת תאיםכימוטקסיס של fMLPדגימת ליחה של COPD