本文介绍了一种用于单分子水平高精度FRET实验的方案。此外，该方法还可用于鉴定N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体配体结合域中的三种构象状态。精确测定距离是基于FRET实验构建结构模型的第一步。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
本文介绍了一种在多参数荧光检测（MFD）模式下单分子水平上利用荧光共振能量转移（FRET）进行高精度染料间距离测量的实验方案。MFD充分利用荧光的所有"维度"，以减少光物理和实验中的伪影，从而在刚性生物大分子中实现精度高达约1 Å的染料间距离测量。该方法已被用于鉴定N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体配体结合域的三种构象状态，进而解释受体在配体结合后的激活机制。在将已知的晶体结构与实验测量结果进行比较时，对于更具动态性的生物大分子，两者差异小于3 Å。若能获得覆盖生物大分子全部构象维度的一组距离约束数据，则有望构建出动态生物大分子的结构模型。
引言
结构生物学研究的一个基本目标是揭示生物大分子机器结构与功能之间的关系。20世纪50年代，随着X射线晶体学的发展，人们首次获得了生物大分子（例如蛋白质和核酸）的可视化图像1,2。X射线晶体学可提供高分辨率的静态结构信息，但这些信息受到晶体堆积的限制。因此，X射线结构模型固有的静态特性忽略了生物大分子的动态本质，而这种动态特性对大多数生物学功能具有重要影响3,4,5。核磁共振（NMR）6,7,8通过在水溶液中解析结构模型，为这一问题提供了另一种解决方案。NMR的一大优势在于能够揭示生物大分子的内在动态特性和构象集合，有助于阐明结构、动力学与功能之间的内在联系3,4,5。然而，NMR受限于样品尺寸和所需样品量较大，对于较大的体系需要复杂的标记策略。因....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. PBS缓冲液配制与腔室处理
注意：进行湿化学实验时需穿戴实验服和一次性手套。调整激光器时需佩戴护目镜。
- PBS缓冲液的配制
- 将4.5 g Na2HPO4、0.44 g NaH2PO4和3.5 g NaCl溶解于400 mL蒸馏水中。调节pH至7.5，并在液体循环模式下高压灭菌1小时（根据高压灭菌器系统而定）。
- 取15 mL PBS溶液，加入0.1 g活性炭，混匀。使用普通的20 mL注射器滤器（孔径0.2 µm）过滤混合液。密封后于室温保存PBS缓冲液。
- 显微镜用带腔盖玻片的处理
- 向带腔盖玻片系统（见材料列表）中加入500 µL蒸馏水和5 µL非离子表面活性剂聚山梨酯20（见材料列表），充分混匀。浸泡30分钟。吸除聚山梨酯20溶液，用蒸馏水冲洗腔体两次。让其自然干燥。
注意：此时腔体已可使用。
- 向带腔盖玻片系统（见材料列表）中加入500 µL蒸馏水和5 µL非离子表面活性剂聚山梨酯20（见材料列表），充分混匀。浸泡30分钟。吸除聚山梨酯20溶液，用蒸馏水冲洗腔体两次。让其自然干燥。
2. DNA 样本制备
注意：使用设计好的带标记DNA链（参见材料列表）来制备双链DNA（d....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在使用MFD装置的典型单分子FRET实验中（激光波长：485 nm，功率60 µW；640 nm，功率23 µW，见第5.1节），荧光样品被稀释至低皮摩尔浓度（10-12 M = 1 pM）并置于共聚焦显微镜中，通过亚纳秒激光脉冲激发在激发体积内自由扩散的标记分子。典型的共聚焦体积为 <4飞升（fL）。在如此低的浓度下，每次仅能检测到单个分子。标记分子发出的荧光通过物镜收集，并利用针孔进行空间滤波。此步骤定义了一个有效的共聚焦检测体积。随后，信号在两个（或多个）不同的光谱窗口被分为平行和垂直分量。例如， “绿色”和“红色”）。每个光子探测器通道随后连接至时间相关单光子计数（TCSPC）电子系统，用于数据采集（图1).
完成MFD装置的校准（该步骤总结于表1中的第5–6步）后，即可开始对dsDNA标准品进行测量。随后，采用PIE-MFD分析多.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本研究介绍了利用 PIE-MFD 单分子 FRET 实验对染料间距离进行高精度对齐、校准和测量的实验方案。通过精确校准所有仪器参数，可提高所测距离的准确性，并达到埃级精度。为此，采用多种多维直方图来分析并识别待进一步表征的群体。利用平均宏时间验证所测样品的稳定性，可对供体和受体的光漂白进行校正，并根据化学计量参数选择 FRET 群体。然而，受体的光物理性质可能随标记位置的不同而发生变化。因此，可利用 SPIE 分布对受体量子产率进行准确校正。准确的光物理表征对于确定伽马因子（ƴ）至关重要，该因子结合其他校正因子（例如，用于串扰的 α 因子和用于供体激光激发受体的 β 因子），可提高所测染料间距离的准确性。该方法通过两种设计的双链 DNA 标准样品进行了验证，与预期值相比，测得距离的准确性达到约 1 Å。
不同的染料选择需要调整显微镜的光学元件，例如二向色镜和带通滤光片，以匹配所选染料的合适光谱窗口。相应地，也需要选择合适的脉冲激光器。更重要的是，染料的选择至关重要，因为可能存在多种光物理伪影，例如受体和供体漂白、三重态或染料.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
所有作者声明，他们对本文内容不存在任何竞争性经济利益。
致谢
VJ 和 HS 感谢美国国立卫生研究院（NIH）R01 GM094246 项目对 VJ 的资助。HS 感谢克莱姆森大学创意探究项目（Creative Inquiry Program）以及克莱姆森大学光学材料科学与工程技术创新中心（Center for Optical Materials Science and Engineering Technologies）提供的启动资金。本项目还获得了墨西哥湾海岸联盟（Gulf Coast Consortia）跨学科生物科学培训凯克中心（Keck Center for Interdisciplinary Bioscience Training）培训奖学金（NIGMS 资助编号：1 T32GM089657-05）以及 Schissler 基金会常见人类疾病转化研究奖学金对 DD 的资助。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 活性炭 | Merck KGaA | K42964486 320 | |
| 注射器滤器 | Fisherbrand | 09-719C | 孔径：0.20 µm |
| 多孔盖玻片 | Fisher Scientific | 155409 | 1.5 硼硅酸盐玻璃，8 孔 |
| 显微镜盖玻片 | Fisher Scientific | 063014-9 | 尺寸：24 × 60-1.5 |
| 无核酸酶水 | Fisher Scientific | 148859 | 无核酸酶 |
| 吐温-20 | Thermo Scientific | 28320 | 10% 聚山梨酯 20 溶液 |
| 受体 DNA 链（高 FRET） | Integrated DNA Technologies | 178124895 | 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC) |
| 受体 DNA 链（低 FRET） | Integrated DNA Technologies | 177956424 | 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC) |
| 供体 DNA 链 | Integrated DNA Technologies | 177951437 | 5´ -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG) |
| DNA 链（无 FRET） | Integrated DNA Technologies | 5´ -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC) | |
| PCR 仪 | Eppendorf | E6331000025 | nexus gradient |
| Alexa Fluor 488 C5 Maleimide | Thermo Scientific | A10254 | 文中称为青绿色荧光团 |
| Alexa Fluor 647 C2 Maleimide | Thermo Scientific | A20347 | 文中称为远红荧光团 |
| 罗丹明 110 | Sigma-Aldrich | 83695-250MG | |
| 罗丹明 101 | Sigma-Aldrich | 83694-500MG | |
| LB 培养基（Miller 配方） | Fisher Scientific | BP1426 | 用于培养 E. coli |
| 氨苄青霉素 | Sigma-Aldrich | A0166 | 在选择性 LB 培养基中终浓度为 100 µg/mL，用于维持质粒筛选 |
| 四环素 | Calbiochem | 58346 | 在选择性 LB 培养基中终浓度为 12.5 µg/mL，用于维持 Origami B(DE3) 菌株中的 gor（谷胱甘肽还原酶）突变，以促进二硫键氧化 |
| 卡那霉素 | Fisher Scientific | BP906-5 | 在选择性 LB 培养基中终浓度为 15 µg/mL，用于维持 B(DE3) 菌株中的 trxB（硫氧还蛋白还原酶）突变，以促进二硫键氧化 |
| Origami B(DE3) 感受态细胞 | Millipore | 70837-3 | 适用于表达含二硫键蛋白的 E. coli 感受态细胞 |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG） | Fisher Scientific | BP1755 | 用于诱导 E. coli 蛋白表达 |
| HiTrap Chelating HP | GE Life Sciences | 17-0409-01 | 用于大规模 FPLC 纯化带 His 标签的蛋白 |
| 咪唑 | Sigma-Aldrich | 56749 | |
| Ni-NTA 琼脂糖 | Qiagen | 30210 | |
| PD-10 脱盐柱 | GE Life Sciences | 17-0851-01 | |
| AktaPurifier | GE Life Sciences | 28406264 | FPLC 仪器 |
| 透析袋 | Spectrum labs | 132562 | 截留分子量 15 kD，扁平宽度 24 mm，10 米/卷 |
| 二向色镜 | Semrock | FF500/646-Di01-25x36 | 500/646 BrightLight |
| 50/50 偏振分光棱镜 | Qioptiq Linos | G33 5743 000 | 10 × 10 薄膜偏振片 |
| 绿色通滤光片 | Chroma | ET525/50m | ET525/50m，25 mm 直径安装座 |
| 红色通滤光片 | Chroma | ET720/150m | ET720/150m，25 mm 直径安装座 |
| 功率计 | ThorLabd | PM200 | |
| 紫外-可见分光光度计 | Varian | Cary300Bio | |
| Fluorolog 3 荧光计 | Horiba | FL3-22-R3 | |
| Fluorohub TCSPC 控制器 | Horiba | Fluorohub-B | 用于整体测量的 TCSPC 电子设备 |
| NanoLed 485L | Horiba | 485L | 蓝色二极管激光器 |
| NanoLed 635L | Horiba | 635L | 红色二极管激光器 |
| Olympus IX73 显微镜 | Olympus | IX73P2F | 显微镜主体 |
| PMA 40 混合探测器 | PicoQuant GmbH | 932200, PMA 40 | 优化用于绿色荧光检测 |
| PMA 50 混合探测器 | PicoQuant GmbH | 932201, PMA 50 | 优化用于红移灵敏度检测 |
| 485 nm 激光器 | PicoQuant GmbH | LDH-D-C-485 | |
| 640 nm 激光器 | PicoQuant GmbH | LDH-D-C-640 | |
| Hydraharp 400 及 TTTR 采集软件 | PicoQuant | 930021 | 皮秒事件计时器及时间相关单光子计数单元，包含 TTTR 采集软件 |
| SEPIA II SLM 828 及 SEPIA 软件 | PicoQuant | 910028 | 用于皮秒脉冲的激光驱动器，包含 SEPIA 软件控制器 |
| 计算机 | Dell | optiplex 7010 | CPU：i7-3770，内存：16 GB |
| FRET 定位与筛选（FPS）软件 | Heinrich Heine University | 包含可在 http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html 获取的可及体积计算器 | |
| MFD 套件 | Heinrich Heine University | 包含 BIFL 软件包 Paris；Margarita 用于多参数直方图可视化，以及可在 http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html 获取的概率分布分析软件 |
参考文献
- Kendrew, J. C. Architecture of a protein molecule. Nature. 182 (4638), 764-767 (1958).
- Kendrew, J. C., et al. A three-dimensional model of the myoglobin molecule obtained by x-ray analysis. Nature. 181 (4610), 662-666 (1958).
- Henzler-Wildman, K., Kern, D.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
