Легкий лист на основе флуоресцентной микроскопии живых или фиксированных и окрашенных<em> Tribolium castaneum</em> Эмбрионы

Summary

Визуализации морфогенеза эмбрионов насекомых с легкой листовой основой флуоресцентной микроскопией стало состоянием искусства. Этот протокол описывает и сравнивает три монтажных методов , подходящих для Tribolium castaneum эмбрионов, представляет две новые заказные линии трансгенные хорошо подходят для живых изображений, обсуждает основные контроля качества и указывает на существующие экспериментальные ограничения.

Abstract

Красный жук муки Tribolium castaneum стала важной моделью насекомых организма в области генетики развития и эволюционной биологии развития. Наблюдение Tribolium эмбрионов с легкой листовой основой флуоресцентной микроскопией имеет несколько преимуществ по сравнению с обычными широкопольным и конфокальной флуоресцентной микроскопией. Из-за уникальных свойств светового листа на основе микроскопа, трехмерные изображения живых образцов могут быть записаны с высоким соотношением сигнал-шум и значительно уменьшить фото-отбеливание, а также фото-токсичностью по нескольким направлениям в течение периодов, которые длятся несколько дней. Обладая более чем четырех лет развития методологии и непрерывного увеличение данных, время представляется целесообразным установить стандартные рабочие процедуры для использования светотехники листов в сообществе Tribolium, а также в сообществе насекомых в целом. Этот протокол описывает три крепежных методов, пригодных еили различные цели, представляют два новых заказные трансгенные линии Tribolium подходят для долгосрочного живого изображения, предлагают пять флуоресцентных красители для маркировки внутриклеточных структур фиксированных эмбрионов и предоставляют информацию о данных постобработке для своевременной оценки записанных данных. Представитель результатов сосредоточиться на долгосрочном живом изображении, оптическое секционирование и наблюдении того же эмбрион вдоль нескольких направлений. Соответствующие наборы данных предоставляются в виде загружаемого ресурса. И, наконец, протокол обсуждает контроль качества для анализов живых изображений, существующих ограничений и применимости, указанных процедур к другим видам насекомых.

Этот протокол предназначен прежде всего для биологов развития, которые ищут решение визуализации, превосходящую стандартное лабораторное оборудование. Это способствует непрерывную попытке ликвидировать разрыв между технически ориентированными лабораториями / сообществами, которые разрабатывают и уточняют Microsкопировать методологически, и жизнь научные лаборатории / сообщества, которые требуют решения «подключи и работай» технических проблем. Кроме того, он поддерживает аксиоматический подход, который перемещает биологические вопросы в центре внимания.

Introduction

Красная мука жук Tribolium castaneum, который принадлежит к большому семейству чернотелок (Tenebrionidae), имеет долгую историю в области сельского хозяйства и наук о жизни и является вторым наиболее изученным модель модель насекомое организм после того, как плодовой мушки дрозофилы. В течение последних четырех десятилетий, она стала мощной и популярной моделью насекомых организм в генетике развития, эволюционной биологии развития и, в течение последних двадцати лет, в эмбриональном морфогенезе по целому ряду причин:

Drosophila и Tribolium оба принадлежат к Holometabola, но расходились около 300 миллионов лет назад ^{1, 2, 3, 4.} В то время как эмбриональное развитие дрозофилы обычно считаются весьма производными, Tribolium показывает более наследственный режим Develтие , который найден в значительно большем количестве видов насекомых ^{5, 6, 7, 8, 9.} Во – первых, Tribolium демонстрирует развитие не-инволютированную головы, то есть его ротовые и усики появляются уже в процессе эмбриогенеза ^{10, 11, 12, 13, 14, 15.} Во- вторых, Tribolium следует принципам развития короткого ростка, т.е. брюшные сегменты последовательно добавляют из зоны роста задней во germband удлинением ^{16, 17, 18, 19.} В- третьих, Tribolium развивается и позже деградируетдва внеэмбриональные мембраны , т.е. амнион, который покрывает только эмбрион вентрально, и серозное, который обволакивает эмбрион полностью ^{20, 21, 22.} Обе мембрана играет важные морфогенетическое ^23, а также защитную роль в отношении микроорганизмов , ^{24, 25} и ²⁶ высыхания. В- четвертых, в зародыше развивающиеся ноги полностью работоспособны в течение личиночной стадии жизни и служат зачатков для взрослых ног во время куколки метаморфоза ^{27, 28, 29, 30, 31.}

Из – за их малого размера и скромные требования, выращивание Tribolium в лаборатории довольно просто. Культуры дикого типа (WT) , штаммы или трансгенные линии , как правило , состоит из около 100-300 взрослых и может храниться в течение одного-литровых стеклянных бутылок (80 следа см ²⁾ , заполненные от трех до четырех сантиметров (около 50 г) с ростовой средой, состоящей из полного зерна пшеницы муки с добавлением неактивных сухих дрожжей. Подача воды не требуется. Это позволяет даже небольшие лаборатории, чтобы держать десятки жука культур в пределах малых и средних коммерчески доступных инкубаторах насекомых. Более поздние стадии развития Tribolium (личинки примерно через четвертую возрастную стадию, куколки и взрослые) легко отделяются от ростовой среды путем просеивания. Синхронные эмбрионы получаются путем инкубирования взрослых в течение коротких периодов времени на яйцекладки среды. Для быстрого развития, жук культуры выдерживают при 32 ° C (около четырех недель в поколение), в то время складского учета обычно проводят при температуре 22-25 ° С (около десяти недель на поколение).

В течение последнего десятилетия, многие стандартные ТЕСhniques постепенно адаптированы и оптимизированы для Tribolium, как представлено в книгах Emerging модельных организмов ^32. Большое значение имеют расширенный генетические методы , такие как эмбриональное ^33, личиночной ^{34, 35} или родительская ^{36, 37} РНК – интерференции на основе гена нокдаун, зародышевой преобразование либо с PiggyBac ^{38, 39} или система транспозаза Минос ⁴⁰ и CRISPR / геном cas9 на основе инжиниринг ^41. Кроме того, Tribolium геном был секвенирован около десяти лет назад ^42, и в настоящее время в третьем раунде генома узла выпуска ^43, что позволяет эффективно и геном идентификации и систематический анализ генов ⁴⁴ </sвверх> или другие генетические элементы ^{45, 46.} Кроме того, геном четырех других видов жесткокрылых доступны для сравнительных генетических подходов ^{47, 48, 49, 50.} В ассоциации с виртуализированным геномом, два крупномасштабных генетические анализы были выполнены, т.е. инсерционного мутагенеза экрана ⁵¹ и гена нокдаун экрана ^{52, 53} Систематическое РНК – интерференция основы.

Флуоресцентный живой визуализации с широкопольных, конфокальной или легкого листа на основе микроскопии (LSFM) позволяет наблюдать эмбриональных морфологии Tribolium как функцию времени (т.е. морфогенез) в многомерном контексте (таблица 1). В широкопольными и конфокальной флуоресцентной микроскопии excitция и излучение света направляется через ту же самую линзу объектива. В обоих подходах весь образец освещается для каждого записываемого двухмерной плоскости. Таким образом, образцы подвергают очень высокий уровень энергии. В LSFM, только флуорофоры в фокальной плоскости возбуждаются за счет расцепления освещения и обнаружения с помощью двух перпендикулярно расположенных линз объектива (фиг.1). LSFM поставляется в двух канонические реализаций – единственная плоскость освещения микроскопа (SPIM) и цифровой сканируется лазерный луч листа на основе флуоресцентного микроскопа (DSLM, рисунок 2) – и предлагает несколько важных преимуществ по сравнению с традиционными подходами: (я) внутренняя способность оптического секционирования, (II) хорошее осевое разрешение, (III) сильно сниженный уровень фото-отбеливания, (IV) очень низкая фото-токсичность, (v) высокое отношение сигнал-шум, (VI) относительно высокая скорость сбора данных, (VII) формирования изображения по нескольким направлениям и (VIб) более глубокое проникновение ткани за счет использования низкой освещенности числовая апертура линзы объектива ^{54, 55, 56.}

LSFM уже успешно применяется в Tribolium к документу почти весь эмбриональный морфогенеза ⁵⁷ и проанализировать принципы внеэмбрионального разрыва мембраны в начале закрытия дорсальных ^23. Для того, чтобы повысить привлекательность LSFM в сообществе Tribolium и для науки насекомых в целом, это имеет большое значение для установления стандартных рабочих процедур и совершенствование методов, протоколов и пула ресурсов до уровня , где микроскоп становится простотой -Использование стандартного инструмента в развитии биологии лабораторий, а также биологические вопросы остаются в центре внимания.

Этот протокол начинается с основами Tribolium </ EM> выращивание, т.е. содержание, размножение и сбор эмбрионов. Далее, две экспериментальные стратегии проиллюстрированы: (я) живая визуализация заказных линий трансгенных и (б) формирования изображения фиксированных эмбрионов , которые были окрашенными флуоресцентными красителями (Таблица 2). Впоследствии три монтажные методы с несколько различными целями подробно описаны (рис 3 и таблицей 3): (я) агарозный колонок, (II) агарозное полушарие и (III) роман держатель паутины. Протокол затем объясняет процедуру сбора данных с LSFM. методы визуализации и ключевые соображения изложены. И, наконец, извлечение эмбриона объясняется и предложения для основной обработки данных предоставляются. В репрезентативных результатов, живые данные изображений из двух новых на заказ и глии-голубые ⁵⁸ трансгенные линии показаны и соответствующие наборы данных изображений представлены в виде загружаемого ресурса. Кроме того, изображениеДанные фиксированных эмбрионов, которые были окрашены с различными флуоресцентными красителями представлены. Обсуждение фокусируется на контроле качества, существующих ограничения подхода живого изображения и адаптацию протокола к другим видам.

Протокол написан для легких листовых на основе флуоресцентных микроскопов, которые оснащены отборную камеру и с возможностью вращения механизма зажима для стандартных держателей образцов ^{54, 59, 60,} которые , как правило цилиндрической формы элементы , изготовленные из металла, пластика или стекла с диаметром в миллиметровом диапазоне. Протокол также подходит для обоих канонические реализаций, т.е. SPIM и DSLM, а также для установок с двумя или более освещения и обнаружения оружия ^{61, 62, 63.} Представительные результаты показывают данные в двух спектральных каналах, зеленый (ILLumination с 488 нм лазера, обнаружение с помощью 525/50 полосовой фильтр) и красный (освещение с 561 нм лазера, обнаружение через 607/70 полосовой фильтр), но протокол может быть расширена до трех или четырех спектральных каналов.

Protocol

1. Земледелие из Tribolium культур Примечание: Стандартные условия определяются как при температуре инкубации 25 ° С и 70% относительной влажности в течение 12 ч светлых / 12 ч темнота. Для получения более подробной информации о Tribolium хозяйства, соответствующие рекоменда?…

Representative Results

Этот протокол описывает экспериментальную основу для флуоресцентной визуализации живых или фиксированных и окрашенных эмбрионов Tribolium с LSFM. Из-за низкие уровни фото-отбеливание и фото-токсичность, является прямым следствием его способности оптического секцион…

Discussion

Контроль качества

В анализах живых изображений, процедура подготовки и записей должна быть неинвазивной, то есть ни механический и обработки химических (сбор, dechorionation, монтаж на держатель образца) , ни интегрированной энергетической нагрузку во время набл…

Materials

full grain wheat flour	Demeter e.V.	1.13E+08	US: whole wheat flour, UK: whole meal flour
405 fine wheat flour	Demeter e.V.	1.13E+08	US: pastry flour, UK: soft flour
inactive dry yeast	Flystuff / Genesee Scientific	62-106
phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010-023
sodium hypochlorite, ~12% active Cl	Sigma Aldrich	425044-250ML	Caution: sodium hypochlorite is corrosive
low-melt agarose	Carl Roth	6351.2
6-well plate	Orange Scientific	4430500
24-well plate	Orange Scientific	4430300
glass capillaries, internal Ø 0.46 mm	Brand GmbH + Co KG	7087 09
SYTOX Green	Thermo Fisher Scientific	57020	Staining solution preparation is explained in Table 2
YOYO-1 Iodide	Thermo Fisher Scientific	Y3601	Staining solution preparation is explained in Table 2
BOBO-3 Iodide	Thermo Fisher Scientific	B3586	Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 546 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A22283	Staining solution preparation is explained in Table 2
sieve, 800 µm mesh size	VWR International	200.025.222-051
sieve, 710 µm mesh size	VWR International	200.025.222-050	for growth medium preparation (step 1.1)
sieve, 300 µm mesh size	VWR International	200.025.222-040
sieve, 250 µm mesh size	VWR International	200.025.222-038	for egg laying medium preparation (step 1.2)
glass dish, Ø 100 mm × 20 mm	Sigma Aldrich	CLS70165102
cell strainer, 100 µm mesh size	BD Biosciences	352360
paint brush, head Ø 2 mm	VWR International	149-2121
syringe, 1.0 ml	B. Braun Medical AG	9166017V
scintillation vials	Sigma Aldrich	M1152-1000EA
paraformaldehyde	Sigma Aldrich	158127	Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive
n-heptane ≥ 99%	Carl Roth	8654.1	Caution: n-heptane is flammable and toxic
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ML	Caution: Trition X-100 is corrosive