Lys Sheet-baserede Fluorescence Microscopy af Leve- eller fikseres og farves<em> Tribolium castaneum</em> Embryoner

Summary

Billeddannelse af morfogenese af insekt embryoer med lys ark-baserede fluorescensmikroskopi er blevet stade. Denne protokol skitserer og sammenligner tre monteringsteknikker passende for Tribolium castaneum embryoner, indfører to hidtil ukendte skræddersyede transgene linier velegnede til billeddannelse, diskuterer væsentlige kvalitetskontrol og angiver de aktuelle eksperimentelle begrænsninger.

Abstract

Den røde mel bille Tribolium castaneum er blevet et vigtigt insekt model organisme i udviklingsmæssige genetik og evolutionær udviklingsmæssige biologi. Observationen af Tribolium embryoer med lys ark-baserede fluorescensmikroskopi har flere fordele i forhold til konventionel Vidvinklet og konfokal fluorescensmikroskopi. På grund af de unikke egenskaber af en lyspladen-baserede mikroskop, kan tredimensionelle billeder af levende prøver registreres med højt signal-støj-forhold og væsentligt reduceret foto-blegning samt foto-toksicitet langs flere retninger over perioder, der varer flere dage. Med mere end fire års metodeudvikling og en fortsat stigning af data, synes passende tid til at etablere standardprocedurer for brugen af lys ark teknologi i Tribolium samfund såvel som i insekt samfundet som helhed. Denne protokol beskrives tre monteringsteknikker egnede feller forskellige formål, præsenterer to nye skræddersyede transgene Tribolium linjer passende for langsigtet direkte billedvisning, foreslår fem fluorescerende farvestoffer at mærke intracellulære strukturer af faste embryoner og giver oplysninger om data efterbehandling til rettidig evaluering af de registrerede data. Repræsentative resultater koncentrere sig om langsigtet billeddannelse, optiske sektionering og observation af den samme embryo langs flere retninger. De respektive datasæt leveres som en download ressource. Endelig protokollen diskuterer kvalitetskontrol for lever imaging-analyser, aktuelle begrænsninger og anvendeligheden af ​​de skitserede procedurer til andre insektarter.

Denne protokol er primært beregnet til udviklingsmæssige biologer, der søger imaging-løsninger, der udkonkurrerer standard laboratorieudstyr. Det fremmer den kontinuerlige forsøg på at lukke hullet mellem de teknisk orienterede laboratorier / samfund, der udvikler og forfiner mikroerkopiere metodisk, og life science laboratorier / samfund, som kræver 'plug-and-play' løsninger på tekniske udfordringer. Desuden er det understøtter en aksiomatisk tilgang, der bevæger de biologiske spørgsmål i centrum for opmærksomhed.

Introduction

Den røde mel bille Tribolium castaneum, der hører til den store familie af skyggebiller (Tenebrionidae), har en lang historie inden for landbrugs- og biovidenskab og er den anden bedst undersøgte model insekt model organisme efter bananfluen Drosophila melanogaster. I løbet af de sidste fire årtier, blev det en kraftfuld og populær insekt model organisme i udviklingsmæssige genetik, i evolutionær udviklingsmæssige biologi og i løbet af de sidste tyve år, i embryonale morfogenese for en række forskellige årsager:

Drosophila og Tribolium begge tilhører den Holometabola, men afveg ca. 300 millioner år siden ^{1, 2, 3, 4.} Mens den embryoniske udvikling af Drosophila almindeligvis betragtes som særdeles afledt, Tribolium viser en mere nedarvet tilstand af udvikling, der findes i en væsentligt større andel af insektarter ^{5, 6, 7, 8, 9.} For det første Tribolium udviser ikke-involuted hoved udvikling, dvs. dens munddele og antenner dukke allerede under embryogenese ^{10, 11, 12, 13, 14, 15.} For det andet, Tribolium følger de principper for kortvarige kim udvikling, dvs. abdominal segmenter tilsættes sekventielt fra en posterior vækst zone i germband forlængelse ^{16, 17, 18, 19.} For det tredje, Tribolium udvikler og senere nedbrydesto ekstra-embryonale membraner dvs. amnion, som dækker embryonet kun ventralt, og serosa, som indhyller embryonet helt ^{20, 21, 22.} Begge membraner spiller en afgørende morfogenetiske ²³ samt beskyttende rolle mod mikroorganismer ^{24, 25} og udtørring ^26. For det fjerde har embryonically udviklingslandene ben er fuldt funktionelle i larvestadiet livsfase og tjene som primordier for de voksne ben under puppe metamorfose ^{27, 28, 29, 30, 31.}

På grund af deres lille størrelse og beskedne krav, dyrkning af Tribolium i laboratoriet er forholdsvis ligetil. Kulturer af vildtype (WT) stammer eller transgene linjer består typisk af omkring 100-300 voksne og kan holdes inden for én-liters glasflasker (fodaftryk 80 ^cm2) fyldt tre til fire centimeter høje (ca. 50 g) med vækstmedium, som består af fuldnarvet hvede mel suppleret med inaktiv tørgær. En vandforsyning er ikke nødvendig. Dette tillader selv små laboratorier til at holde snesevis af beetle kulturer inden små eller mellemstore kommercielt tilgængelige insekt inkubatorer. Senere udviklingsstadier af Tribolium (larver efter ca. fjerde stadiums, pupper og voksne) adskilles let fra vækstmediet ved sigtning. Synkroniserede embryoner opnås ved at inkubere voksne i korte perioder på æglægning medium. For udvikling bliver beetle kulturer holdt ved 32 ° C (ca. fire uger pr generation), mens lagerføring udføres typisk ved 22-25 ° C (omkring ti uger om generation).

Inden for det sidste årti, mange standard techniques gradvist er blevet tilpasset og optimeret til Tribolium, som sammenfattet i det spirende modelorganismer bøger ^32. Af stor betydning er avancerede genetiske metoder såsom embryoniske ^33, larve- ^{34, 35} eller parental ^{36, 37} RNA-interferens-baserede gen knockdown, kimlinietransformation med enten piggyBac ^{38, 39} eller Minos ⁴⁰ transposase-system og CRISPR / Cas9-baserede genom engineering ^41. Desuden har Tribolium genomet blevet sekventeret omkring et årti siden ^42, og er nu i den tredje runde af genom samling frigive ^43, der muliggør effektiv og hele genomet identifikation og systematisk analyse af gener ⁴⁴ </sop> eller andre genetiske elementer ^{45, 46.} Derudover genomerne fra fire andre billelarver arter er tilgængelige til sammenlignende genetiske tilgange ^{47, 48, 49, 50.} I association med den genom, har to store genetiske analyser udført, dvs. en insertionsmutagenese skærm ⁵¹ og en systematisk RNA-interferens-baserede gen knockdown skærm ^{52, 53.}

Fluorescens billeddannelse med Vidvinklet, konfokal eller lys ark-baserede mikroskopi (LSFM) gør det muligt at observere det embryoniske morfologi Tribolium som funktion af tiden (dvs. den morfogenese) i et flerdimensionalt sammenhæng (tabel 1). I Vidvinklet og konfokal fluorescensmikroskopi, den Excitation og emission lys ledes gennem det samme objektiv. I begge tilgange er hele prøven belyst for hver registreret todimensionalt plan. Derfor er prøverne udsat for meget høje energiniveauer. I LSFM, kun fluoroforerne i brændplanet exciteres på grund af en afkobling af belysning og påvisning ved anvendelse af to vinkelret anbragte objektivlinser (figur 1). LSFM kommer i to kanoniske implementeringer – den enkelt plan belysning mikroskop (SPIM) og de digitale scannede laserlys ark-baserede fluorescensmikroskop (DSLM, figur 2) – og giver flere vigtige fordele i forhold til traditionelle fremgangsmåder: (i) iboende optisk sektionering kapacitet, (ii) god aksial opløsning, (iii) kraftigt reduceret niveau af foto-blegning, (iv) meget lav foto-toksicitet, (v) højt signal-til-støj-forhold, (vi) relativt høj erhvervelse hastighed, (vii) afbildning langs flere retninger og (VIii) dybere vævspenetration grund af brugen af lav numerisk apertur belysningsobjektivsystem linser ^{54, 55, 56.}

LSFM er allerede blevet anvendt med succes i Tribolium at dokumentere næsten hele embryonale morfogenese ⁵⁷ og analysere principperne for ekstra-embryonale membran brud i begyndelsen af dorsale lukning ^23. For at hæve tiltrækningskraft LSFM i Tribolium samfundet og for insekt videnskab i almindelighed, er det af stor betydning at etablere standardprocedurer og forbedre de metoder, protokoller og den pulje af ressourcer til et niveau, hvor mikroskopet bliver en lethed-i -Brug standardværktøj i udviklingsmæssige biologiske laboratorier, og de biologiske spørgsmål bo i centrum for opmærksomhed.

Denne protokol begynder med det grundlæggende i Tribolium </ em> dyrkning, dvs. vedligeholdelse, reproduktion og embryonindsamlingsteam. Derefter to eksperimentelle strategier illustreret: (i) levende billeddannelse af skræddersyede transgene linier og (ii) afbildning af faste embryoner, der blev farvet med fluorescerende farvestoffer (tabel 2). Efterfølgende tre monteringsteknikker med lidt forskellige formål forklaret detaljeret (figur 3 og tabel 3): (i) agarosesøjlen, (ii) agarose halvkugle og (iii) spindelvæv holder roman. Protokollen derefter forklarer proceduren for dataopsamling med LSFM. Billeddiagnostiske metoder og centrale overvejelser er skitseret. Endelig embryo hentning forklaret og forslag til grundlæggende databehandling leveres. I de repræsentative resultater, live billeddata fra to hidtil ukendte skræddersyede og Glia-blå ⁵⁸ transgene linier er vist, og de respektive billeddannende datasæt er tilvejebragt som en downloades ressource. Derudover billededata af faste embryoner, der blev farvet med en række fluorescensfarvestoffer præsenteres. Diskussionen fokuserer på kvalitetskontrol, nuværende begrænsninger i direkte billedvisning tilgang og tilpasning af protokollen til andre arter.

Protokollen er skrevet til lette flade baseret fluorescensmikroskoper der er udstyret med et prøvekammer og en roterbar klemme mekanisme for standardiserede prøveholdere ^{54, 59, 60,} der typisk er cylinderformede elementer fremstillet af metal, plast eller glas med en diameter i millimeterområdet. Protokollen er også velegnet til både kanoniske implementeringer, dvs. spim og DSLM samt for opstillinger med to eller flere belysning og afsløring arme ^{61, 62, 63.} De repræsentative resultater viser data i to spektrale kanaler, grøn (illumination med en 488 nm laser, detektion gennem et 525/50 båndpasfilter) og rød (belysning med en 561 nm laser, detektion gennem et 607/70 båndpasfilter), men protokollen kan udvides til tre eller fire spektrale kanaler.

Protocol

1. Husbandry af Tribolium Cultures BEMÆRK: Standard betingelser er defineret som en inkubationstemperatur på 25 ° C og 70% relativ fugtighed i en 12 h lys / 12 timer mørke cyklus. For mere information om Tribolium dyrehold, respektive retningslinjer er tilgængelige 64. Denne protokol kræver to forskellige mel-baserede medier, som kan fremstilles i kilogram mængder og lagres i flere måneder. Før arbejde med mel og inaktiv tørgær,…

Representative Results

Denne protokol beskriver en eksperimentel ramme for fluorescensafbildning af levende eller fikseret og farvet Tribolium embryoer med LSFM. På grund af de lave niveauer af foto-blegning og foto-toksicitet, en direkte konsekvens af dets optiske sektionering kapacitet, LSFM er særligt velegnet til langsigtede direkte billedvisning. Den hidtil ukendte AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 transgen linje udtrykker et histone2…

Discussion

Kvalitetskontrol

I levende imaging assays, skal proceduren forberedelse og optagelse være ikke-invasiv, dvs. hverken den mekaniske og kemiske håndtering (indsamling, dechorionation, montering på prøveholderen) eller integrerede energi belastning under observationen bør påvirke levedygtigheden af prøven. For undersøgelser, der karakteriserer WT udvikling, anbefales det kun at bruge data fra forsøg, hvor fosteret overlever optagelsen, hentes med succes og udv…

Materials

full grain wheat flour	Demeter e.V.	1.13E+08	US: whole wheat flour, UK: whole meal flour
405 fine wheat flour	Demeter e.V.	1.13E+08	US: pastry flour, UK: soft flour
inactive dry yeast	Flystuff / Genesee Scientific	62-106
phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010-023
sodium hypochlorite, ~12% active Cl	Sigma Aldrich	425044-250ML	Caution: sodium hypochlorite is corrosive
low-melt agarose	Carl Roth	6351.2
6-well plate	Orange Scientific	4430500
24-well plate	Orange Scientific	4430300
glass capillaries, internal Ø 0.46 mm	Brand GmbH + Co KG	7087 09
SYTOX Green	Thermo Fisher Scientific	57020	Staining solution preparation is explained in Table 2
YOYO-1 Iodide	Thermo Fisher Scientific	Y3601	Staining solution preparation is explained in Table 2
BOBO-3 Iodide	Thermo Fisher Scientific	B3586	Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 546 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A22283	Staining solution preparation is explained in Table 2
sieve, 800 µm mesh size	VWR International	200.025.222-051
sieve, 710 µm mesh size	VWR International	200.025.222-050	for growth medium preparation (step 1.1)
sieve, 300 µm mesh size	VWR International	200.025.222-040
sieve, 250 µm mesh size	VWR International	200.025.222-038	for egg laying medium preparation (step 1.2)
glass dish, Ø 100 mm × 20 mm	Sigma Aldrich	CLS70165102
cell strainer, 100 µm mesh size	BD Biosciences	352360
paint brush, head Ø 2 mm	VWR International	149-2121
syringe, 1.0 ml	B. Braun Medical AG	9166017V
scintillation vials	Sigma Aldrich	M1152-1000EA
paraformaldehyde	Sigma Aldrich	158127	Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive
n-heptane ≥ 99%	Carl Roth	8654.1	Caution: n-heptane is flammable and toxic
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ML	Caution: Trition X-100 is corrosive