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Developmental Biology

लाइट शीट के आधार पर जीने की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी या फिक्स्ड और स्टेन्ड<em> Tribolium castaneum</em> भ्रूण

Published: April 28, 2017
doi:
10.3791/55629
, ,
1Physical Biology,Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), 2Cluster of Excellence Frankfurt,Macromolecular Complexes, 3Goethe-Universität Frankfurt am Main – Campus Riedberg

Summary

प्रकाश चादर आधारित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ कीट भ्रूण के morphogenesis इमेजिंग कला के राज्य बन गया है। यह प्रोटोकॉल की रूपरेखा और तीन बढ़ते Tribolium castaneum भ्रूण के लिए उपयुक्त तकनीक तुलना, दो उपन्यास कस्टम निर्मित ट्रांसजेनिक लाइनों में अच्छी तरह से लाइव इमेजिंग के लिए अनुकूल का परिचय है, आवश्यक गुणवत्ता नियंत्रण पर चर्चा करता है और वर्तमान प्रयोगात्मक सीमाओं इंगित करता है।

Abstract

लाल आटा बीटल Tribolium castaneum विकास आनुवंशिकी और विकासवादी विकास जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण कीट मॉडल जीव बन गया है। प्रकाश चादर आधारित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ Tribolium भ्रूण के अवलोकन पारंपरिक widefield और कोंफोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ इसने कई फायदे हैं। एक प्रकाश चादर आधारित माइक्रोस्कोप के अद्वितीय गुणों के कारण, रहने वाले नमूनों में से तीन आयामी छवियों उच्च संकेत से शोर अनुपात के साथ दर्ज किया जा सकता और काफी अवधि कि कई पिछले से अधिक फोटो विरंजन के साथ-साथ कई दिशाओं के साथ तस्वीर विषाक्तता कम दिन। Methodological विकास और डेटा की एक सतत वृद्धि के चार से अधिक वर्षों के साथ, समय Tribolium समुदाय में प्रकाश चादर प्रौद्योगिकी के उपयोग के लिए भी कीट समुदाय में के रूप में बड़े पैमाने पर मानक संचालन प्रक्रियाओं की स्थापना करने के लिए उपयुक्त लगता है। यह प्रोटोकॉल तीन बढ़ते च उपयुक्त तकनीक का वर्णनया विभिन्न प्रयोजनों के दो उपन्यास कस्टम निर्मित ट्रांसजेनिक Tribolium लाइनों लंबे समय तक जीना इमेजिंग के लिए उपयुक्त प्रस्तुत करता है, पाँच फ्लोरोसेंट रंजक तय भ्रूण के intracellular संरचनाओं लेबल करने के लिए सुझाव देता है और दर्ज आंकड़ों के समय पर मूल्यांकन के लिए डेटा पोस्ट-प्रोसेसिंग के बारे में जानकारी प्रदान करता है। प्रतिनिधि परिणाम लंबे समय तक जीना इमेजिंग, ऑप्टिकल सेक्शनिंग और कई दिशाओं के साथ एक ही भ्रूण के अवलोकन पर ध्यान केंद्रित। संबंधित डेटासेट एक डाउनलोड संसाधन के रूप में प्रदान की जाती हैं। अंत में, प्रोटोकॉल को लाइव इमेजिंग assays, वर्तमान सीमाओं और अन्य कीट प्रजातियों को रेखांकित किया प्रक्रियाओं की प्रयोज्यता के लिए गुणवत्ता नियंत्रण की चर्चा।

इस प्रोटोकॉल मुख्य रूप से विकास जीव जो इमेजिंग समाधान है कि मानक प्रयोगशाला उपकरणों मात की तलाश के लिए है। यह तकनीकी रूप से केंद्रित प्रयोगशालाओं / समुदायों, जो विकास और माइक्रो को निखारने के बीच की खाई को बंद करने के निरंतर प्रयास को बढ़ावा देता हैmethodologically प्रतिलिपि बनाएँ, और जीवन विज्ञान प्रयोगशालाओं / समुदायों, जो तकनीकी चुनौतियों का सामना करने के लिए 'प्लग-एंड-प्ले' समाधान की आवश्यकता है। इसके अलावा, यह एक स्वयंसिद्ध दृष्टिकोण है कि ध्यान के केंद्र में जैविक सवालों ले जाता है का समर्थन करता है।

Introduction

लाल आटा बीटल Tribolium castaneum, जो कजलानेवाला बीट्लस के बड़े परिवार (Tenebrionidae) के अंतर्गत आता है, कृषि और जीवन विज्ञान के भीतर एक लंबा इतिहास रहा है और दूसरा सबसे अच्छा अध्ययन किया फल के बाद मॉडल कीट मॉडल जीव ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर मक्खी है। पिछले चार दशकों के दौरान, यह विकासवादी विकास जीव विज्ञान में विकास आनुवंशिकी में एक शक्तिशाली और लोकप्रिय कीट मॉडल जीव बन गया, और, पिछले बीस वर्षों के दौरान, कई कारणों से के लिए भ्रूण morphogenesis में:

ड्रोसोफिला और Tribolium दोनों Holometabola के हैं, लेकिन लगभग 300 मिलियन साल पहले 1, 2, 3, 4 अलग हुए। ड्रोसोफिला के भ्रूण के विकास आम तौर पर अत्यधिक व्युत्पन्न माना जाता है, Tribolium devel का एक और अधिक पैतृक मोड से पता चलताopment कि कीट प्रजातियों 5, 6, 7, 8, 9 की एक काफी बड़ा अनुपात में पाया जाता है। सबसे पहले, Tribolium गैर involuted सिर विकास दर्शाती है, यानी अपनी mouthparts और एंटीना embryogenesis 10, 11, 12, 13, 14, 15 के दौरान पहले से ही उभरते हैं। दूसरे, Tribolium शॉर्ट रोगाणु विकास, यानी पेट क्षेत्रों germband बढ़ाव 16, 17, 18, 19 के दौरान एक पीछे विकास क्षेत्र से क्रमिक रूप से जुड़ जाते हैं के सिद्धांतों इस प्रकार है। तीसरा, Tribolium विकसित करता है और बाद में खराबी आ रहीदो अतिरिक्त भ्रूण झिल्ली भ्रूणावरण है, जो भ्रूण केवल पेट को शामिल किया गया, और serosa, जो भ्रूण पूरी तरह से envelops 20, 21, 22 अर्थात्। दोनों झिल्ली एक महत्वपूर्ण मॉर्फ़ोजेनेटिक 23 के साथ ही सूक्ष्मजीवों 24, 25 और सुखाना 26 के खिलाफ रक्षात्मक भूमिका निभाते हैं। चौथा, embryonically विकासशील पैर लार्वा जीवन चरण के दौरान पूरी तरह से कार्य कर रहे हैं और पोटा संबंधी कायापलट 27, 28, 29, 30, 31 के दौरान वयस्क पैरों के लिए primordia के रूप में सेवा करते हैं।

उनके छोटे आकार और मामूली मांगों के कारण, प्रयोगशाला में Tribolium की खेती काफी सरल है। जंगली प्रकार की संस्कृति (WT) उपभेदों या ट्रांसजेनिक लाइनों आम तौर पर चारों ओर 100-300 वयस्कों से मिलकर बनता है और एक लीटर कांच की बोतलें (पदचिह्न 80 सेमी 2) भरे तीन से चार सेंटीमीटर उच्च (लगभग 50 ग्राम) विकास का माध्यम है कि पूरा अनाज गेहूं के होते हैं के साथ भीतर रखा जा सकता है आटा निष्क्रिय सूखा खमीर के साथ पूरक। एक पानी की आपूर्ति आवश्यक नहीं है। यह यहां तक ​​कि छोटे प्रयोगशालाओं छोटे या मध्यम आकार के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कीट इन्क्यूबेटरों के भीतर बीटल संस्कृतियों के दर्जनों रखने के लिए अनुमति देता है। Tribolium के बाद विकास के चरणों (लार्वा लगभग के बाद चौथे इनस्टार, प्यूपा और वयस्कों) आसानी से sieving द्वारा विकास माध्यम से अलग होती है। सिंक्रनाइज़ भ्रूण अंडे बिछाने माध्यम पर संक्षिप्त अवधि के लिए वयस्कों विकासशील द्वारा प्राप्त कर रहे हैं। तेजी से विकास के लिए, बीटल संस्कृतियों, 32 डिग्री सेल्सियस (पीढ़ी प्रति के बारे में चार सप्ताह) पर रखा जाता है, जबकि स्टॉक रखने को आम तौर पर 22-25 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है (लगभग दस सप्ताह पीढ़ी के अनुसार)।

पिछले एक दशक के भीतर, कई मानक टीईसीhniques धीरे-धीरे अनुकूलित किया गया है और Tribolium के लिए अनुकूलित, उभरती हुई मॉडल जीवों किताबें 32 में संक्षेप के रूप में। काफी महत्व की उन्नत हैं जैसे कि भ्रूण 33 के रूप में आनुवंशिक तरीकों, लार्वा 34, 35 या अभिभावकों की 36, 37 आरएनए हस्तक्षेप आधारित जीन नॉकडाउन, या तो piggyBac 38, 39 या 40 मिनोस Transposase प्रणाली और CRISPR / Cas9 आधारित जीनोम के साथ germline परिवर्तन इंजीनियरिंग 41। इसके अलावा, Tribolium जीनोम के बारे में एक दशक पहले 42 अनुक्रम निर्धारण किया गया है, और जीनोम के तीसरे दौर विधानसभा 43 जारी है, जो कुशल और जीनोम चौड़ा पहचान और जीन 44 के व्यवस्थित विश्लेषण की अनुमति देता है में है </sऊपर> या अन्य आनुवंशिक तत्वों 45, 46। इसके अतिरिक्त, चार अन्य coleopteran प्रजातियों के जीनोम तुलनात्मक आनुवंशिक दृष्टिकोण 47, 48, 49, 50 के लिए उपलब्ध हैं। अनुक्रम जीनोम के साथ मिलकर दो बड़े पैमाने पर आनुवंशिक विश्लेषण एक इन्सर्शनल म्युटाजेनेसिस स्क्रीन 51 और एक व्यवस्थित आरएनए हस्तक्षेप आधारित जीन पछाड़ना स्क्रीन 52, 53 यानी, प्रदर्शन किया गया है।

Widefield, कोंफोकल या प्रकाश चादर आधारित माइक्रोस्कोपी (LSFM) के साथ प्रतिदीप्ति लाइव इमेजिंग एक बहु-आयामी संदर्भ (तालिका 1) में समय के एक समारोह (यानी morphogenesis) के रूप में Tribolium की भ्रूण आकृति विज्ञान निरीक्षण करने के लिए अनुमति देता है। widefield और कोंफोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में, Excitव्यावहारिक और उत्सर्जन प्रकाश एक ही उद्देश्य लेंस के माध्यम से निर्देशित है। दोनों दृष्टिकोण में, पूरे नमूना हर दर्ज की गई दो आयामी विमान के लिए प्रकाशित किया जाता है। इसलिए, नमूनों बहुत ही उच्च ऊर्जा स्तर के अधीन हैं। LSFM में, केवल फोकल विमान में fluorophores दो लंबवत व्यवस्था की ऑब्जेक्टिव लेंस (चित्रा 1) का उपयोग करके रोशनी और पता लगाने के एक decoupling की वजह से बहुत उत्साहित हैं। LSFM दो कैनन कार्यान्वयन में आता है – एक विमान रोशनी माइक्रोस्कोप (SPIM) और डिजिटल स्कैन किया लेजर प्रकाश चादर आधारित प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (DSLM, चित्रा 2) – और पारंपरिक दृष्टिकोण पर कई महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है: (i) आंतरिक ऑप्टिकल सेक्शनिंग क्षमता, (ii) अच्छा अक्षीय संकल्प, (iii) फोटो विरंजन की दृढ़ता से कम स्तर, (iv) बहुत कम तस्वीर विषाक्तता, (v) उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात, (vi) अपेक्षाकृत उच्च अधिग्रहण गति, (छ) इमेजिंग कई दिशाओं और (vi के साथकम संख्यात्मक एपर्चर रोशनी ऑब्जेक्टिव लेंस 54, 55, 56 के उपयोग के कारण ii) गहरी ऊतक प्रवेश।

LSFM पहले से ही सफलतापूर्वक लगभग पूरे भ्रूण morphogenesis 57 दस्तावेज़ के लिए और पृष्ठीय बंद 23 की शुरुआत में अतिरिक्त भ्रूण झिल्ली टूटना के सिद्धांतों का विश्लेषण करने के Tribolium में लागू किया गया है। Tribolium समुदाय में और सामान्य रूप में कीट विज्ञान के लिए LSFM के आकर्षण बढ़ाने के लिए, यह काफी महत्व की है मानक संचालन प्रक्रियाओं की स्थापना के लिए और तरीकों, प्रोटोकॉल और एक स्तर के लिए संसाधनों की पूल में सुधार करने के जहां माइक्रोस्कोप एक आसानी से हो जाता है विकासात्मक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में मानक उपकरण प्रयोग, और जैविक सवालों ध्यान के केंद्र में रहते हैं।

यह प्रोटोकॉल Tribolium की मूल बातें <साथ शुरू होता है/ em> खेती, यानी रखरखाव, प्रजनन और भ्रूण संग्रह। इसके बाद, दो प्रयोगात्मक रणनीति दर्शाए गए हैं: (i) विशेष रूप से निर्मित ट्रांसजेनिक लाइनों की लाइव इमेजिंग और (ii) तय भ्रूण कि फ्लोरोसेंट रंजक (तालिका 2) के साथ दाग रहे थे की इमेजिंग। (I) agarose स्तंभ, (ii) agarose गोलार्द्ध और (iii) उपन्यास मकड़ी का जाला धारक: बाद में, थोड़ा अलग उद्देश्यों के साथ तीन बढ़ते तकनीक विस्तार (चित्रा 3 और 3 तालिका) में विस्तार से बताया गया है। प्रोटोकॉल तो LSFM साथ डाटा अधिग्रहण प्रक्रिया बताते हैं। इमेजिंग तौर तरीकों और महत्वपूर्ण विचार दिए गए हैं। अंत में, भ्रूण पुनर्प्राप्ति समझाया गया है और बुनियादी डाटा प्रोसेसिंग के लिए सुझाव दिए गए हैं। प्रतिनिधि परिणामों में, से लाइव इमेजिंग डेटा दो उपन्यास विशेष रूप से निर्मित और Glia नीले 58 ट्रांसजेनिक लाइनों दिखाया जाता है और संबंधित इमेजिंग डेटासेट एक डाउनलोड संसाधन के रूप में प्रदान की जाती हैं। साथ ही, छवितय भ्रूण के डेटा है कि प्रतिदीप्ति रंजक की एक किस्म साथ दाग रहे थे प्रस्तुत कर रहे हैं। चर्चा गुणवत्ता नियंत्रण, लाइव इमेजिंग दृष्टिकोण की वर्तमान सीमाओं और अन्य प्रजातियों के लिए प्रोटोकॉल के अनुकूलन पर केंद्रित है।

प्रोटोकॉल प्रकाश चादर आधारित प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी कि एक नमूना कक्ष और मानकीकृत नमूना धारकों 54, 59, 60, जो आमतौर पर सिलेंडर के आकार का एक व्यास के साथ धातु, प्लास्टिक या कांच के बने तत्व हैं के लिए एक घूर्णन योग्य क्लैंप तंत्र से लैस हैं के लिए लिखा है मिलीमीटर रेंज में। प्रोटोकॉल भी दोनों कैनन कार्यान्वयन, यानी SPIM और DSLM, साथ ही दो या अधिक रोशनी और पहचान हथियार 61, 62, 63 के साथ सेटअप के लिए के लिए उपयुक्त है। प्रतिनिधि परिणाम दो वर्णक्रमीय चैनलों में डेटा बताते हैं, हरे (इलएक 488 एनएम लेजर, का पता लगाने के एक के माध्यम से 525/50 607/70 फिल्टर bandpass एक के माध्यम से फिल्टर) और लाल (एक 561 एनएम लेजर के साथ रोशनी, का पता लगाने bandpass), लेकिन प्रोटोकॉल के साथ Lumination तीन या चार वर्णक्रमीय चैनलों के लिए विस्तारित किया जा सकता।

Protocol

1. Tribolium संस्कृतियों का पालन नोट: मानक स्थितियों में एक 12 घंटे उज्ज्वल / 12 घंटे अंधेरे चक्र 25 डिग्री सेल्सियस और 70% सापेक्ष आर्द्रता के एक ऊष्मायन तापमान के रूप में परिभाषित कर रहे हैं। Tribolium प?…

Representative Results

यह प्रोटोकॉल जीवन यापन की प्रतिदीप्ति इमेजिंग या LSFM साथ तय की और दाग Tribolium भ्रूण के लिए एक प्रयोगात्मक ढांचे का वर्णन है। तस्वीर-विरंजन और फोटो विषाक्तता, अपनी ऑप्टिकल सेक्शनिंग क्षमता क?…

Discussion

गुणवत्ता नियंत्रण

लाइव इमेजिंग assays में, तैयारी और रिकॉर्डिंग प्रक्रिया, गैर इनवेसिव होना चाहिए यानी न यांत्रिक और रासायनिक से निपटने (संग्रह, dechorionation, नमूना धारक पर बढ़ते) और न ही अवलो…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम तकनीकी सहायता के लिए स्वेन प्लाथ धन्यवाद। Glia नीले ट्रांसजेनिक लाइन ग्रेगर बुचर (गौटिंगेन, जर्मनी) से एक तरह का उपहार था। अनुसंधान उत्कृष्टता फ्रैंकफर्ट के क्लस्टर द्वारा वित्त पोषित किया macromolecular परिसर (CEF-एम सी, EXC 115, स्पीकर वोल्कर डो्स्च) गेटे पर आण्विक लाइफ साइंसेज के लिए Buchmann संस्थान (BMLS, निदेशक इंरिको श्लेइफ) पर EHKS भाग में दी गई am Main यूनिवर्सिटैट फ्रैंकफर्ट ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) द्वारा मुख्य हूँ।

Materials

full grain wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: whole wheat flour, UK: whole meal flour
405 fine wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: pastry flour, UK: soft flour
inactive dry yeast Flystuff / Genesee Scientific 62-106
phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010-023
sodium hypochlorite, ~12% active Cl Sigma Aldrich 425044-250ML Caution: sodium hypochlorite is corrosive
low-melt agarose Carl Roth 6351.2
6-well plate Orange Scientific 4430500
24-well plate Orange Scientific 4430300
glass capillaries, internal Ø 0.46 mm Brand GmbH + Co KG 7087 09
SYTOX Green Thermo Fisher Scientific 57020 Staining solution preparation is explained in Table 2
YOYO-1 Iodide Thermo Fisher Scientific Y3601 Staining solution preparation is explained in Table 2
BOBO-3 Iodide Thermo Fisher Scientific B3586 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 546 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22283 Staining solution preparation is explained in Table 2
sieve, 800 µm mesh size VWR International 200.025.222-051
sieve, 710 µm mesh size VWR International 200.025.222-050 for growth medium preparation (step 1.1)
sieve, 300 µm mesh size VWR International 200.025.222-040
sieve, 250 µm mesh size VWR International 200.025.222-038 for egg laying medium preparation (step 1.2)
glass dish, Ø 100 mm × 20 mm Sigma Aldrich CLS70165102
cell strainer, 100 µm mesh size BD Biosciences 352360
paint brush, head Ø 2 mm VWR International 149-2121
syringe, 1.0 ml B. Braun Medical AG 9166017V
scintillation vials Sigma Aldrich M1152-1000EA
paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127 Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive
n-heptane ≥ 99% Carl Roth 8654.1 Caution: n-heptane is flammable and toxic
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML Caution: Trition X-100 is corrosive
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Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos. J. Vis. Exp. (122), e55629, doi:10.3791/55629 (2017).
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