Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for Analysen af<em> N</em<sup> 6</sup> -threonylcarbamoyladenosin TcdA-funktion
Summary
En protokol præsenteres for produktion af tRNA (UUU) og analysen af tRNA (UUU) i kompleks med enzymet TcdA ved agarosegel-retardationsassays.
Abstract
Vi demonstrerer metoder til ekspression og oprensning af tRNA (UUU) i Escherichia coli og analysen ved gel-retardationsassays af bindingen af tRNA (UUU) til TcdA, en N6-threonylcarbamoyladenosin (t6A) dehydratase, som cycliserer threonylcarbamoylen Sidekæde fastgjort til A37 i anticodon stamme loop (ASL) af tRNA'er til cyklisk t 6 A (ct 6 A). Transkription af det syntetiske gen, der koder for tRNA (UUU), induceres i E. coli med 1 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG), og cellerne indeholdende tRNA høstes 24 timer efter induktion. RNA-fraktionen renses ved anvendelse af den sure phenolekstraktionsmetode. Rent tRNA opnås ved en gelfiltreringskromatografi, som effektivt adskiller de små tRNA-molekyler fra større intakte eller fragmenterede nukleinsyrer. For at analysere TcdA-binding til tRNA (UUU) blandes TcdA med tRNA (UUU) og adskilles på en native agarosegel ved 4 ° C.Det frie tRNA (UUU) migrerer hurtigere, mens TcdA-tRNA (UUU) -komplekserne undergår en mobilitetsretardation, som kan observeres ved farvning af gelen. Vi demonstrerer, at TcdA er et tRNA (UUU) bindende enzym. Dette gel-retardationsassay kan anvendes til at studere TcdA-mutanter og virkningerne af additiver og andre proteiner på binding.
Introduction
Gel-retardationsassayet 1 (også kendt som elektroforetisk mobilitetsforskydningsassay, EMSA) er en elektroforetisk metode designet til at studere og karakterisere protein-nukleinsyre-interaktioner. Det muliggør analyse af protein-DNA såvel som protein-RNA-interaktioner og især interaktioner mellem tRNA og tRNA-bindende proteiner ved anvendelse af enten rensede komponenter eller komplekse blandinger af proteiner ( f.eks . Cellelysater) eller nukleinsyrer ( fx tRNA pools). Vi har anvendt gelretarderingsassays til undersøgelsen af interaktionen mellem oprenset tRNA (UUU) og TcdA, en N6-threonylcarbamoyladenosin (t6A) dehydratase, som cycliserer threonylcarbamoyl-sidekæden fastgjort til A37 i anticodon-stamcellen (ASL) Af tRNA'er til cyklisk t6 (ct 6A) 2 , 3 . TcdA er også kendt som CsdL 3 ,F "> 4. TcdA / csdL genet danner en klynge med csdA- og csdE- generne 5 , som koder for cystein-desulfurasen og svovlacceptoren af cysteinsulfinase desulfinat-systemet (CSD) og er påkrævet for at opretholde TcdA-funktion in vivo 3 .
Baggrunden for gel-retardationsanalyserne er, at mens de frie nukleinsyremolekyler hurtigt overføres til forsiden af acrylamid- eller agarosegeler på grund af deres store negative ladning, reduceres den elektroforetiske mobilitet af proteinkomplekser af de samme nukleinsyrer dramatisk. Reduktionen i mobilitet visualiseres som et "skift" i nukleinsyre-protein-komplekserne, som løser som diskrete bånd. Positivt ladet og større nukleinsyre-proteinkompleks viser en større forskydning eller reduktion i mobilitet på en gel.
Da ladningsneutralisering af komplekset er et universelt fænomenFor protein-nukleinsyrekomplekser kan gelretarderingsassayet påføres et bredt spektrum af komplekser og nukleinsyretyper. Metoden er enkel, billig og kan udføres i laboratorier med minimum udstyr. Det kræver kun små mængder proteiner og tRNA. Dette er en fordel i forhold til alternative biofysiske teknikker, som normalt forbruger større mængder prøve.
Gel-retardationsassayet er blevet anvendt i vid udstrækning til undersøgelsen af transkriptionsfaktorer. Assayet er blevet anvendt til at analysere bindende kinetik, styrke og specificitet af transkriptionsfaktorer for mange forskellige DNA-sekvenser. Det var faktisk på dette område, at EMSA blev udviklet 6 , 7 . Gelretarderingsassays med RNA 8 , 9 , 10 , 11 og tRNA-molekyler er også blevet anvendt i ribosomforskningOg at analysere, som vi gør her, de enzymer, der modificerer tRNA nucleosider post-transkriptionelt.
Mange forskellige parametre påvirker resultatet af et gelretarderingsassay, såsom temperatur, kvalitet af proteinet og tRNA-prøven og bindingsstyrken. Omhyggelig planlægning og udførelse af eksperimentet er afgørende for fortolkningen af resultaterne af den frie nukleinsyre og proteinbundne arter. Her anvendte vi det syntetiske gen kodende for tRNA (UUU) klonet i en ekspressionsvektor, hvis promotor mangler Shine-Dalgarno ribosombindingsstedet, hvilket fører til syntese af store mængder af tRNA 2 . Denne detaljerede protokol er beregnet til at give en klar vejledning til udførelse af tRNA gelretardationsforsøg, samtidig med at man undgår almindelige fejl.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protein-tRNA agarosegelretarderingsassayet beskrevet heri kan modificeres på en række måder. For det første kan procentdelen af agarose i gelen reduceres for at muliggøre adskillelse og visualisering af protein-tRNA-komplekser signifikant større end den her analyserede (120 kDa). For det andet, hvis målproteinet er termolabilt, skal der træffes ekstra forholdsregler for at sikre, at temperaturen holdes under den maksimale acceptable temperatur ved at flytte elektroforeseapparatet til et forkølelokale elle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MCV er medlem af CIB Intramural Program "Molecular Machines for Better Life" (MACBET). Den forskning, der fører til disse resultater, har modtaget finansiering fra det spanske institut Salud Carlos III (PI12 / 01667 til MCV), Spaniens ministerium for økonomi og konkurrenceindivid (CTQ2015-66206-C2-2-R og SAF2015-72961-EXP til MCV ), Den regionale regering i Madrid (S2010 / BD-2316 til MCV) og Europa-Kommissionen (rammeprogram 7 (RP7)) projektet ComplexINC (Kontrakt nr. 279039 til MCV). Fundersne havde ingen rolle i studiedesign, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre eller udarbejde manuskriptet.
Materials
| E. coli BL21(DE3) | Novagen | 70235 | DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction. |
| pET23d | Novagen | 69748-3 | pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter. |
| LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated | Melford | GL1703 | Conventional LB Broth, High Salt, can also be used. |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | 10419313 | |
| Incubator Shaker (Thermostated) | NBS | Excella E24 | Any shaker incubator with temperature control can be used. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), >=99% | Acros Organics | BP1755 | |
| Sodium acetate, anhydrous, >99% | Melford | B4017 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, >99% | Acros Organics | AC327205000 | Harmful if inhaled. |
| Centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5430 | |
| Centrifuge (refrigerated) rotor | Eppendorf | 5430/5430P | |
| Centrifuge | Sorvall | RC5C | |
| Centrifuge rotor | Sorvall | SLA-3000 | |
| Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 ± 0.2 | Sigma-Aldrich | P4682 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive |
| Ethanol absolute for analysis, 100% v/v | Merck Millipore | 100983 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na2HPO4, >=99% | Sigma-Aldrich | 71643 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | Merck | 48,730,250 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 75 | GE Healthcare | 28989333 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl] | Melford | T1513 | |
| Boric Acid | Melford | B0503 | |
| Microwave | Haier | HDA-2070M | |
| TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride] | Sigma-Aldrich | C4706 | Corrosive to metals and skin. |
| ATP [Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, >=99% | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Magnesium chloride (MgCl2), anhydrous, >=98% | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium chloride (NaCl), >99% | Fisher Bioreagents | BP358 | |
| Potassium chloride (KCl), >99% | Melford | P0515 | |
| NZYDNA Ladder VI | NZYtech | MB8901 | |
| Power supply | Consort | EV261 | |
| Electrophoresis unit | Real Laboratory | RELSMINI10 | |
| Real Safe nucleic acid staining | Real Laboratory | RBMSAFE | 20,000X stock |
| UV Transilluminator (G:Box/EF) | Syngene | 2216498 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Rocker (Gyro-Rocker) | Stuart | SSL3 | |
| Mixer Vortex | Fisher brand | 13214789 |
References
- Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
- López-Estepa, M., et al. The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily. Plos One. 10 (4), e0118606 (2015).
- Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification. Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).
- Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system. J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).
- Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli. J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).
- Fried, M. G., Crothers, D. M. Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction. J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Rio, D. C. Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions. Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).
- Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions. Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).
- Hagel, L. Gel-filtration chromatography. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
