प्रोटीन-टीआरएनए एगरोस जेल डिटैडेडेशन एसेरेस ऑफ़ द एनालिसिस<em> एन</em<sup> 6</sup> -रेरोनीएल्कार्बामॉलेडिनोसिन टीसीडीए फंक्शन
Summary
एक प्रोटोकॉल टीआरएनए (यूयूयू) के उत्पादन के लिए प्रस्तुत किया गया है और एंजॉयस जेएल रिटेडेडेन एशेज द्वारा एंजाइम टीसीडीए के साथ परिसर में टीआरएनए (यूयूयू) का विश्लेषण किया गया है।
Abstract
हम एस्चेरीचिया कोलाई में टीआरएनए (यूयूयू) की अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण के तरीकों को और टीआरएनए (यूयूयू) के बंधन के जीएल रिटर्डेशन एसेल्स द्वारा एनसी -6 -थोरोनिलकार्बामॉलेडेनोसिन (टी 6 ए) डीहाइड्राटेस के विश्लेषण का प्रदर्शन करते हैं, जो थ्रेनील्कार्बामॉयल चक्रीय टी 6 ए (सीटी 6 ए) में टीआरएनए के एंटीकोडन स्टेम लूप (एएसएल) में A37 से जुड़ी साइड चेन। सिंथेटिक जीन एन्कोडिंग टीआरएनए (यूयूयू) का ट्रांसक्रिप्शन ई। कोलाई में 1 एमएम isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (आईपीटीजी) के साथ प्रेरित किया जाता है और टीआरएनए वाले कोशिकाओं को 24 घंटे के बाद शामिल किया जाता है। आरएनए अंश को एसिड फिनोल निष्कर्षण पद्धति का उपयोग करके शुद्ध किया जाता है। शुद्ध टीआरएनए एक जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी द्वारा प्राप्त किया जाता है जो बड़े अक्षुण्ण या खंडित न्यूक्लिक एसिड से छोटे आकार के टीआरएनए अणुओं को कुशलता से अलग करता है। टीसीडीए को टीआरएनए (यूयूयू) के लिए बाइंडिंग का विश्लेषण करने के लिए, टीसीडीए को टीआरएनए (यूयूयू) के साथ मिश्रित किया जाता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक देशी एगरोस जेल पर अलग होता हैनि: शुल्क टीआरएनए (यूयूयू) तेजी से पलायन करता है, जबकि टीसीडीए-टीआरएनए (यूयूयू) परिसरों में गतिशीलता मंदता होती है जिसे जेल के धुंधला पर देखा जा सकता है। हम यह दर्शाते हैं कि टीसीडीए एक टीआरएनए (यूयूयू) -बाइंडिंग एंजाइम है। इस जेल की मंदता परख का उपयोग टीसीडीए म्यूटेंट और बाइंडिंग पर एडिटिव्स और अन्य प्रोटीन के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
जेल रिडर्डेशन परख 1 (जिसे इलेक्ट्रोफोरेक्टिक गतिशीलता पारी परख के रूप में भी जाना जाता है, ईएमएसए) प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड इंटरैक्शन को अध्ययन और विशेषता के लिए डिज़ाइन किया गया एक इलेक्ट्रोफोरेक्टिक विधि है। यह प्रोटीन-डीएनए के विश्लेषण के साथ-साथ प्रोटीन-आरएनए बातचीत और विशेष रूप से, टीआरएनए और टीआरएनए बाध्यकारी प्रोटीन के बीच बातचीत, या तो शुद्ध घटकों या प्रोटीन के जटिल मिश्रण ( जैसे , सेल lysates) या न्यूक्लिक एसिड ( जैसे , टीआरएनए पूल)। हमने शुद्ध टीआरएनए (यूयूयू) और टीसीडीए, एन 6- थ्रेनीएल्कार्बामॉलेडिनोसिन (टी 6 ए) डिहाइड्रेटसे के बीच बातचीत के अध्ययन के लिए जेल रिटेडेडेन एशेज लागू किया है, जो एंटीकोडन स्टेम लूप (एएसएल) में ए 37 से जुड़े थ्रेनील्कार्बामॉयल साइड चेन को साइक्सेल करता है। टीआरएनए की चक्रीय टी 6 (सीटी 6 ए) 2 , 3 टीसीडीए को सीएसडीएल 3 के रूप में भी जाना जाता है ,एफ "> 4। टीसीडीए / सीएसडीएल जीन सीएसडीए और सीएसडीई जीन 5 के साथ एक क्लस्टर बनाती है, जो सिस्टीन डसफोरास और सिस्टीन सल्फाइनस डिस्ल्टिनेट (सीएसडी) प्रणाली के सल्फर स्वीकर्ता को एनकोड करते हैं और विवो 3 में टीसीडीए फ़ंक्शन को बनाए रखने के लिए आवश्यक है।
जेल रिटेडेडेन एल्स के पीछे का तर्क यह है कि, जबकि मुक्त न्यूक्लिक एसिड अणुओं को उनके बड़े नकारात्मक आरोपों के कारण एक्रिलमाइड या एगरोज़ जेल के मोर्चे पर तेजी से स्थानांतरित किया जाता है, वही न्यूक्लिक एसिड के प्रोटीन परिसरों की इलेक्ट्रोफोरेक्टिक गतिशीलता नाटकीय रूप से कम हो जाती है। गतिशीलता में कमी को न्यूक्लिक एसिड-प्रोटीन परिसरों में एक "बदलाव" के रूप में देखा जाता है, जो असतत बैंड के रूप में तय होता है। सकारात्मक रूप से चार्ज किया गया और बड़ा न्यूक्लिक एसिड-प्रोटीन परिसर एक जेल पर गतिशीलता में अधिक बदलाव या कमी दिखाता है।
चूंकि परिसर के प्रभारी निस्तारण एक सार्वभौमिक घटना हैप्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड कॉम्प्लेक्सों के लिए, जेल डिटैडेडेशन परख परिसर और न्यूक्लिक एसिड प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है। विधि सरल, सस्ती है, और न्यूनतम उपकरणों के साथ प्रयोगशालाओं में आयोजित किया जा सकता है। इसमें प्रोटीन और टीआरएनए की थोड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है। यह वैकल्पिक बायोफिजिकल तकनीक पर एक फायदा है, जो आम तौर पर बड़ी संख्या में नमूने का उपभोग करता है।
प्रतिलेखन कारकों के अध्ययन के लिए जेल की मंदता परख का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। परख कई अलग डीएनए दृश्यों के लिए बाध्यकारी कैनेटीक्स, शक्ति, और प्रतिलेखन कारकों की विशिष्टता का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया गया है। यह वास्तव में इस क्षेत्र में था कि ईएमएसए को पहली बार 6 , 7 विकसित किया गया था। आरआईए 8 , 9 , 10 , 11 और टीआरएनए अणुओं के साथ जेल रिटेडेडेशन एनाल्स का उपयोग राइबोसोम अनुसंधान में किया गया हैऔर विश्लेषण करने के लिए, जैसा कि हम यहां करते हैं, एंजाइमों में टीआरएनए न्यूक्लॉसाइड को ट्रांसलेटिलेशनल पोस्ट के बाद संशोधित किया जाता है।
कई अलग-अलग मापदंडों में जेल की मंदता परख के परिणाम जैसे कि तापमान, प्रोटीन की गुणवत्ता और टीआरएनए नमूना, और बाध्यकारी की शक्ति को प्रभावित करते हैं। नि: शुल्क न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन बाध्य प्रजातियों के परिणामों की व्याख्या के लिए प्रयोग की सावधानीपूर्वक योजना और निष्पादन महत्वपूर्ण है। यहां, हमने सिंथेटिक जीन एन्कोडिंग टीआरएनए (यूयूयू) का उपयोग एक्सप्रैक्शन वेक्टर में किया था जिसका प्रमोटर शाइन-डाल्गर्नो रिबोसोम बाइंडिंग साइट का अभाव है, जिससे टीआरएनए 2 की बड़ी मात्रा में संश्लेषण होता है। सामान्य गलतियों से बचते समय टीआरएनए जेल की मंदता के प्रयोगों के लिए एक स्पष्ट गाइड प्रदान करने के लिए यह विस्तृत प्रोटोकॉल का उद्देश्य है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित प्रोटीन-टीआरएनए एगरोज जेल रेटार्डेशन परख कई तरीकों से संशोधित किया जा सकता है। सबसे पहले, जेल में agarose का प्रतिशत कम हो सकता है जिससे कि प्रोटीन-टीआरएनए कॉम्प्लेक्स की जुदाई और विज़ुअलाइजे?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एमसीवी सीआईबी अंतराल कार्यक्रम "बेहतर जीवन के लिए आणविक मशीनों" (मैकबेट) का सदस्य है। इन परिणामों के लिए अग्रणी शोध स्पैनिश इंस्टीटूटो डी सलाद कार्लोस III (पीआई 12/01667 से एमसीवी), स्पेनी मंत्री मंत्री इंकियाआइए कॉम्पिटिटिडड (सीटीक2015-66206-सी -2-2-आर और एसएएफ2015-72 9 61-एमसीवी को एसईपी) से धन प्राप्त हुआ है। ), मैड्रिड की क्षेत्रीय सरकार (एस -2010 / बीडी -2316 टू एमसीवी), और यूरोपीय आयोग (फ्रेमवर्क प्रोग्राम 7 (एफपी 7)) परियोजना कॉम्प्लेक्सिन (अनुबंध नंबर 279039 से एमसीवी)। फंडर्स का अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी।
Materials
| E. coli BL21(DE3) | Novagen | 70235 | DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction. |
| pET23d | Novagen | 69748-3 | pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter. |
| LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated | Melford | GL1703 | Conventional LB Broth, High Salt, can also be used. |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | 10419313 | |
| Incubator Shaker (Thermostated) | NBS | Excella E24 | Any shaker incubator with temperature control can be used. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), >=99% | Acros Organics | BP1755 | |
| Sodium acetate, anhydrous, >99% | Melford | B4017 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, >99% | Acros Organics | AC327205000 | Harmful if inhaled. |
| Centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5430 | |
| Centrifuge (refrigerated) rotor | Eppendorf | 5430/5430P | |
| Centrifuge | Sorvall | RC5C | |
| Centrifuge rotor | Sorvall | SLA-3000 | |
| Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 ± 0.2 | Sigma-Aldrich | P4682 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive |
| Ethanol absolute for analysis, 100% v/v | Merck Millipore | 100983 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na2HPO4, >=99% | Sigma-Aldrich | 71643 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | Merck | 48,730,250 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 75 | GE Healthcare | 28989333 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl] | Melford | T1513 | |
| Boric Acid | Melford | B0503 | |
| Microwave | Haier | HDA-2070M | |
| TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride] | Sigma-Aldrich | C4706 | Corrosive to metals and skin. |
| ATP [Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, >=99% | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Magnesium chloride (MgCl2), anhydrous, >=98% | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium chloride (NaCl), >99% | Fisher Bioreagents | BP358 | |
| Potassium chloride (KCl), >99% | Melford | P0515 | |
| NZYDNA Ladder VI | NZYtech | MB8901 | |
| Power supply | Consort | EV261 | |
| Electrophoresis unit | Real Laboratory | RELSMINI10 | |
| Real Safe nucleic acid staining | Real Laboratory | RBMSAFE | 20,000X stock |
| UV Transilluminator (G:Box/EF) | Syngene | 2216498 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Rocker (Gyro-Rocker) | Stuart | SSL3 | |
| Mixer Vortex | Fisher brand | 13214789 |
References
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