Isolation des protéines de filament intermédiaires à partir de tissus de souris multiples pour étudier les modifications post-traductionnelles associées au vieillissement

Rachel A. Battaglia; Parijat Kabiraj; Helen H. Willcockson; Melinda Lian; Natasha T. Snider

doi:10.3791/55655

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Article de méthode

Isolation des protéines de filament intermédiaires à partir de tissus de souris multiples pour étudier les modifications post-traductionnelles associées au vieillissement

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DOI :

10.3791/55655

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18 mai 2017

Rachel A. Battaglia¹ , Parijat Kabiraj¹ , Helen H. Willcockson¹ , Melinda Lian¹ , Natasha T. Snider¹

¹Department of Cell Biology and Physiology, School of Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

Dans cet article

Résumé

Dans cette méthode, nous présentons des procédures biochimiques pour l'isolement rapide et efficace des protéines de filament intermédiaire (IF) provenant de multiples tissus de souris. Les IF isolés peuvent être utilisés pour étudier les changements dans les modifications post-traductionnelles par spectrométrie de masse et d'autres analyses biochimiques.

Résumé

Les filaments intermédiaires (IF), ainsi que les filaments d'actine et les microtubules, forment le cytosquelette - un élément structurel critique de chaque cellule. Les mécanismes de fonctionnement normal fournissent aux cellules une résilience mécanique et résistante au stress, tandis qu'un cytosquelette SF dysfonctionnel compromet la santé cellulaire et a été associé à de nombreuses maladies humaines. Les modifications post-traductionnelles (PTM) régulent de manière critique la dynamique de l'IF en réponse aux changements physiologiques et aux conditions de stress. Par conséquent, la capacité de surveiller les changements dans la signature PTM des IF peut contribuer à une meilleure compréhension fonctionnelle et, en fin de compte, le conditionnement du système IF en tant que résonateur de stress pendant les lésions cellulaires. Cependant, le grand nombre de protéines IF, codées par plus de 70 gènes individuels et exprimés de manière dépendant des tissus, est un défi majeur pour trier l'importance relative des PTM différents. À cette fin, des méthodes permettant la surveillance des PTM sur les protéines IFÀ l'échelle de l'organisme, plutôt que pour les membres isolés de la famille, peut accélérer les progrès de la recherche dans ce domaine. Ici, nous présentons des méthodes biochimiques pour l'isolement de la fraction totale, détergente-soluble et détergente des protéines IF de 9 différents tissus de souris (cerveau, coeur, poumon, foie, intestin grêle, intestin grêle, pancréas, rein et rate). Nous démontrons en outre un protocole optimisé pour l'isolement rapide des protéines IF en utilisant la matrice de lysage et l'homogénéisation automatisée de différents tissus de souris. Le protocole automatisé est utile pour le profilage des IF dans des expériences avec un volume élevé d'échantillons (comme dans les modèles de maladies impliquant plusieurs animaux et des groupes expérimentaux). Les échantillons résultants peuvent être utilisés pour diverses analyses en aval, y compris le profil PTM à base de spectrométrie de masse. En utilisant ces méthodes, nous fournissons de nouvelles données pour montrer que les protéines IF dans différents tissus de souris (cerveau et foie) subissent des changements parallèles par rapport à leur expressionLes niveaux de tension et les PTM pendant le vieillissement.

Introduction

Les IF sont une famille de protéines qui, chez l'homme, sont codées par 73 gènes et classées en six types majeurs: les types I-IV sont cytoplasmiques ( par exemple, les kératines épithéliales et capillaires (K), les desmin de myocytes, les neurofilaments, la protéine acide fibrillaire glieuse (GFAP) et d'autres); Type V sont les laminés nucléaires; Et le type VI sont des IF dans l'objectif ¹ . En ce qui concerne leur organisation moléculaire, les protéines IF possèdent trois domaines communs: un domaine de "tige" à bobine enroulée hautement conservé et des domaines globulaires de "tête" et "queue". Les tétrastes de p....