Hjernemembran Fraktionering: An<em> Ex Vivo</em> Tilnærmelse til vurdering af subsynaptisk protein lokalisering
Summary
Her præsenterer vi en hjernemembranfraktioneringsprotokol, der repræsenterer en robust procedure til isolering af proteiner, der tilhører forskellige synaptiske rum.
Abstract
Vurdering af den synaptiske proteinsammensætning og funktion udgør en vigtig udfordring inden for neurovidenskab. Det er imidlertid ikke let at vurdere neurotransmission, der forekommer inden for synaps, fordi den er stærkt reguleret af dynamiske protein-proteininteraktioner og fosforyleringshændelser. Når en metode anvendes til at studere synaptisk transmission, er det derfor vigtigt at bevare disse forbigående fysiologiske modifikationer. Her præsenterer vi en hjernemembranfraktioneringsprotokol, der repræsenterer en robust procedure til isolering af proteiner, der tilhører forskellige synaptiske rum. Med andre ord beskriver protokollen en biokemisk metode til udførelse af proteinberigelse fra presynaptiske, postsynaptiske og ekstrasynaptiske rum. For det første opnås synaptosomer eller synaptiske terminaler fra neuroner, som indeholder alle synaptiske rum ved hjælp af en diskontinuerlig sucrosegradient. Det bemærkes, at kvaliteten af dette indledende synaptiske membranpræparat er critical. Derefter opnås isoleringen af de forskellige subsynaptiske rum med let solubilisering under anvendelse af milde detergenter ved forskellige pH-forhold. Dette muliggør adskillelse ved gradient- og isopykniske centrifugeringer. Endelig valideres proteinberigelse i de forskellige subsynaptiske rum ( dvs. præ-, post- og ekstrasynaptiske membranfraktioner) ved hjælp af immunoblot-analyse ved anvendelse af velkarakteriserede synaptiske proteinmarkører ( dvs. SNAP-25, PSD-95 og synaptofysin, Henholdsvis), hvilket muliggør en direkte vurdering af den synaptiske fordeling af et hvilket som helst bestemt neuronalt protein.
Introduction
Synaptisk transmission er afhængig af synaps fysiske integritet, et koncept, der var planlagt allerede i 1897 af Foster and Sherrington 1 . Således er forståelse for fordelingen af centrale neurotransmissionskomponenter ( f.eks. Ionkanaler, receptorer, etc. ) afgørende for at belyse synaptisk funktion både under normale og patologiske forhold. Elektronmikroskopi (EM) har bidraget enormt til den nuværende ultrastrukturelle opfattelse af prototypiske centralnervesystems (CNS) synaps. EM har således på en sådan måde fastslået forskellene mellem præ- og postsynaptiske tætheder, som adskilles af en spalt af en ret ensartet afstand (~ 25 nm) 2 . Interessant nok udviser det postsynaptiske apparat en relativt kontinuerlig, elektron-tæt fortykning under sin plasmamembran, den såkaldte postsynaptiske densitet eller PSD 2 . Omvendt, ved det præsynaptiske apparat, en notifikationsblankEt diskontinuerligt cytomatrix netværk er anbragt lige under plasmamembranen, hvilket er afgørende for tilpasningen og dockningen af synaptiske vesikler til den plasmamembranaktive zone 3 . Derfor udgør EM den gyldne eksperimentelle tilgang til undersøgelse af fordelingen af proteiner inden for strukturelt bevarede CNS-synapser. Imidlertid er informationen fra elektronmikrografier statisk. Faktisk viser akkumulerende bevismaterialer, at in vivo synapser er ekstremt dynamiske og oplever således dramatiske strukturelle ændringer ved vedvarende synaptisk transmission. Desuden kan morfologien og sammensætningen af synapser ændre sig gennem forskellige CNS-regioner og ved udvikling, modning, aldring og udvikling af neuropatologiske tilstande. Samlet set repræsenterer en protokol om isolering af proteiner, der tilhører forskellige synaptiske rum i fysiologiske forhold, et værdifuldt redskab til en mere omfattende undersøgelse af synaptisk funktion.
<p cLass = "jove_content"> Her beskriver vi denne form for komplementær eksperimentel tilgang, som giver mulighed for den præparative biokemiske berigelse af de forskellige synaptiske membrankamre, nemlig ekstra-, præ- og postsynaptiske membranområder. Denne membranfraktioneringsmetode, først beskrevet af Philips et al . (2001) 4 , er baseret på et pH-skifte, som svækker de klæbende interaktioner der forekommer inden for det præ- og postsynaptiske apparat. For det første er det muligt at skelne adhærensforbindelsen, der indeholder det præ- og postsynaptiske apparat, og som opretholdes fra det ekstrasynaptiske membrandomæne, som er solubiliseret og således kan ekstraheres fra de synaptiske kontakter, ved at anvende milde vaskemidler ved pH 6,0. Efterfølgende hæver pH-værdien fra 6,0 til 8,0 i nærvær af milde vaskemidler styrken af adherensforbindelsen, som holder den presynaptiske aktive zone tæt bundet til den postsynaptiske densitet. Derfor er det presynaptiske rum såledesLubilized og kan adskilles fra den postsynaptiske tæthed, som hovedsagelig bevares, fordi den anvendte koncentration af detergent ikke fremmer dets solubilisering 4 . Interessant nok kan fraktioneringseffektiviteten, som til sidst er højere end 90%, bekræftes af forskellige subsynaptiske markører: i ) synaptosomalt associeret protein 25 (SNAP-25) fra den presynaptiske aktive zone; Ii ) Synaptophysin, fra den ekstrasynaptiske fraktion ( dvs. uden for den aktive zone og inklusiv mikrosomer); Og iii ) postsynaptisk densitetsprotein 95 (PSD-95), fra den postsynaptiske densitet. Især er denne hjernemembranfraktioneringsmetode blevet anvendt med succes. Følgelig har det været muligt præcist at bestemme den subsynaptiske lokalisering af forskellige receptorer, såsom alfa-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsyre (AMPA) receptorer 5 , adenosin A1 receptor (A1R) 6 ,Adenosin A 2A- receptor (A 2A R) 7 , adenosintrifosfat (ATP) P2-receptorer 8 , nicotinacetylcholinreceptorunderenheder 9 og Parkinsons sygdomsassocierede receptor GPR37 10 . En række begrænsninger kan dog hæmme den korrekte vurdering af den synaptiske fordeling af et bestemt neuronalt protein. Således beskriver vi i denne procedure ikke kun hele protokollen fuldstændigt, men vi fremhæver også nogle kritiske punkter, der skal overvejes, såsom den ret store mængde væv, der kræves, lavproteinudbyttet og det obligatoriske krav til at validere effektiviteten af Hver adskillelse inden udførelse af det konkrete eksperiment.Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol presented here constitutes a powerful biochemical tool for the study of the subsynaptic distribution of specific proteins within any brain region. However, there are some drawbacks inherent to the technique that deserve to be highlighted here. For instance, one of the main limitations is the relatively large amount of tissue needed to purify a reasonable amount of protein in order to perform the immunoblot analysis of all subsynaptic fractions. This issue might be related to the fact that synapses (i.e.,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Ministerio de Economia y Competitividad / Instituto de Salud Carlos III (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 og PIE14 / 00034), Instituciò Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA Academia-2010 ), Og Agentschap voor Innovatie door Wetenschap en Technologie (SBO-140028) til FC Også X. M, VF-D og FC tilhører den akkrediterede forskningsgruppe "Neuropharmacology and Pain" (Generalitat de Catalunya, 2014 SGR 1251) . Arbejdet blev også støttet af "Programa Pesquisador Visitante Especial-Ciência sem Fronteiras" fra CAPES (Brasilien) til FC
Materials
| Sucrose | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,316,211,211 | |
| CaCl2 | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 2,112,211,210 | |
| MgCl2·6H2O | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,313,961,210 | |
| Protease inhibitor cocktail Set III | Millipore, Darmstadt, Germany | 535140 | |
| Trizma Base | Sigma, St. Louis, MO, USA | T1503 | |
| Tris-HCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,236,541,209 | |
| Triton X-100 | Sigma, St. Louis, MO, USA | X100 | |
| SDS | Sigma, St. Louis, MO, USA | L3771 | |
| Glycerol | Sigma, St. Louis, MO, USA | G5516 | |
| Bromophenol Blue | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,311,651,604 | |
| Dithiothreitol | Sigma, St. Louis, MO, USA | D0632 | |
| Tween 20 | Sigma, St. Louis, MO, USA | P2287 | |
| Non fat dry milk | |||
| NaCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,216,591,211 | |
| KCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,314,941,210 | |
| KH2PO4 | Merck | 4873 | |
| Na2HPO4 | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,316,781,211 | |
| Basic 20 pH | Crison, Alella, Spain | ||
| Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer | VWR, Radnor, PA, USA. | ||
| Ultra-Clear Tubes (14x89mm) | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | 344059 | Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | UFC901008 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf, Hamburgo, Germany | ||
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | ||
| Sonifier 250 | Branson, Danbury, Connecticut | ||
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain | ||
| Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mm | VWR, Radnor, PA, USA | 612-1702 | |
| Compact Balance EK-610 | A&D, Tokyo, Japan | ||
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA | ||
| SuperSignal west pico chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | ||
| GR 200 Precision Balance | A&D, Tokyo, Japan | ||
| Anti-GPR37 | Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory. | Primary antibodies used at a final concentration of 0.250ug/ml | |
| Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin | Abcam, Cambridge, United Kingdom | Primary antibodies diluted 1:10000 | |
| HRP-conjugated goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Secondary antibody diluted 1:10000 | |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Secondary antibody diluted 1:30000 |
References
- Foster, M., Sherrington, C. S. Part III: The Central Nervous System. A Text Book of Physiology. , (1897).
- Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. . The fine structure of the nervous system. , (1991).
- Harris, K. M., Weinberg, R. J. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, 005587-005587 (2012).
- Phillips, G. R., et al. The presynaptic particle web: ultrastructure, composition, dissolution, and reconstitution. Neuron. 32, 63-77 (2001).
- Pinheiro, P. S., et al. Solubilization and immunological identification of presynaptic alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors in the rat hippocampus. Neurosci. Lett. 336, 97-100 (2003).
- Rebola, N., Pinheiro, P. C., Oliveira, C. R., Malva, J. O., Cunha, R. A. Subcellular localization of adenosine A(1) receptors in nerve terminals and synapses of the rat hippocampus. Brain Res. 987, 49-58 (2003).
- Rebola, N., Canas, P. M., Oliveira, C. R., Cunha, R. A. Different synaptic and subsynaptic localization of adenosine A2A receptors in the hippocampus and striatum of the rat. Neuroscience. 132, 893-903 (2005).
- Rodrigues, R. J. Dual Presynaptic Control by ATP of Glutamate Release via Facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and Inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 Receptors in the Rat. J. Neurosci. 25, 6286-6295 (2005).
- Garção, P., Oliveira, C. R., Cunha, R. A., Agostinho, P. Subsynaptic localization of nicotinic acetylcholine receptor subunits: a comparative study in the mouse and rat striatum. Neurosci. Lett. 566, 106-110 (2014).
- Lopes, J. P., et al. The role of parkinson’s disease-associated receptor GPR37 in the hippocampus: functional interplay with the adenosinergic system. J. Neurochem. 134, 135-146 (2015).
- Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. ILAR J. 38, 41-48 (1997).
- Rusakov, D. A., Harrison, E., Stewart, M. G. Synapses in hippocampus occupy only 1-2% of cell membranes and are spaced less than half-micron apart: a quantitative ultrastructural analysis with discussion of physiological implications. Neuropharmacology. 37, 513-521 (1998).
- Zeng, Z., Su, K., Kyaw, H., Li, Y. A novel endothelin receptor type-B-like gene enriched in the brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 559-567 (1997).
- Bodenmuller, H., Schilling, E., Zachmann, B., Schaller, H. C. The neuropeptide head activator loses its biological acitivity by dimerization. EMBO J. 5, 1825-1829 (1986).
- Rezgaoui, M., et al. The neuropeptide head activator is a high-affinity ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR37. J. Cell Sci. 119, 542-549 (2006).
- Gandìa, J., Fernández-Dueñas, V., et al. The Parkinson’s disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain. J. Neurochem. 125, 362-372 (2013).
- Meyer, R. C., Giddens, M. M., Schaefer, S. A., Hall, R. A. GPR37 and GPR37L1 are receptors for the neuroprotective and glioprotective factors prosaptide and prosaposin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9529-9534 (2013).
- Takahashi, R., Imai, Y. Pael receptor, endoplasmic reticulum stress, and Parkinson’s disease. J. Neurol. 250, 9 (2003).
