हम इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, "फ्लैश और फ्रीज," में एक उपन्यास तकनीक है कि एमएस लौकिक संकल्प के साथ झिल्ली गतिशीलता के दृश्य को सक्षम बनाता विकसित की है। इस तकनीक को उच्च दबाव ठंड के साथ न्यूरॉन्स की optogenetic उत्तेजना को जोड़ती है। यहाँ, हम प्रक्रियाओं का प्रदर्शन और विस्तार से प्रोटोकॉल का वर्णन।
कोशिकाओं लगातार अपनी झिल्ली वास्तुकला और प्रोटीन वितरण बदलने के लिए, लेकिन यह क्रमश: एमएस और एनएम के आदेश पर एक अस्थायी और स्थानिक संकल्प पर इन घटनाओं कल्पना करने के लिए बहुत मुश्किल है। हम एक समय का संकल्प इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीक, "फ्लैश और फ्रीज," कि optogenetics साथ सेलुलर घटनाओं को प्रेरित करता है और उत्तेजना के बाद निर्धारित समय बिंदुओं पर ठंड कोशिकाओं द्वारा जिसके परिणामस्वरूप झिल्ली गतिशीलता की परिकल्पना करती विकसित किया है। इस तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए, हम channelrhodopsin, एक प्रकाश के प्रति संवेदनशील कटियन चैनल, माउस हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में व्यक्त किया। प्रकाश की एक फ्लैश न्यूरोनल गतिविधियों को बढ़ावा और synaptic vesicles के संलयन के माध्यम से synaptic टर्मिनलों से न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज प्रेरित करता है। न्यूरॉन्स की optogenetic उत्तेजना synaptic प्रसारण के दौरान रूपात्मक परिवर्तन का पालन करने के उच्च दबाव ठंड के साथ मिलकर कर रहा है। एक व्यावसायिक साधन का उपयोग करना, हम synaptic vesicles के संलयन और syna की वसूली पर कब्जा कर लियाptic पुटिका झिल्ली। घटनाओं के अनुक्रम कल्पना करने के लिए, बड़े डेटासेट उत्पन्न और, आँख बंद करके विश्लेषण किया के बाद से रूपात्मक परिवर्तन समय के साथ विभिन्न कोशिकाओं में पीछा किया गया था रहे थे। फिर भी, फ्लैश और फ्रीज एमएस लौकिक संकल्प के साथ इलेक्ट्रॉन micrographs में झिल्ली गतिशीलता के दृश्य की अनुमति देता है।
एक कोशिका के भीतर झिल्ली और प्रोटीन गतिशीलता विज्युअलाइजिंग विशेष प्रक्रियाओं की कोशिका जीव विज्ञान को समझने की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है। गतिशील तस्करी की घटनाओं प्रकाश या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर कब्जा कर लिया जा सकता है। हालांकि, subcellular संदर्भ काफी हद तक इस तरह की छवियों में लापता क्योंकि subcellular संरचनाओं नहीं कर सकते पूरी तरह से रंगों या फ्लोरोसेंट जांच से "पेंट" किया और स्थानिक संकल्प लिया और प्रेतसंबंधी 1, 2 है। दूसरी ओर, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी उत्तम विस्तार से subcellular वास्तुकला को चित्रित कर सकते हैं, यह सेलुलर गतिशीलता पर कब्जा नहीं कर सकते, क्योंकि नमूनों इमेजिंग से पहले तय की जानी चाहिए। इस प्रकार, यह आम तौर पर पूरी तरह से केवल एक ही इमेजिंग साधन का उपयोग कर सेलुलर गतिशीलता को समझने के लिए पर्याप्त नहीं है।
प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की सीमाओं को पार करने के लिए, correlative माइक्रोस्कोपी तकनीक विकसित किया गया है। Correlative प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी(क्लेम) प्रकाश माइक्रोस्कोपी और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ अंतर्निहित subcellular संरचनाओं का उपयोग कर intracellular गतिशीलता की परिकल्पना करती। क्लेम में, इस तरह cytokinesis और endocytosis 3, 4, 5, 6 के रूप में विभिन्न प्रक्रियाओं, में लगी हुई कोशिकाओं, लिव-ली गई और यह तो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए संसाधित कर रहे हैं। हालांकि क्लेम intracellular गतिशीलता के कुछ पहलुओं को दर्शाता है, वहाँ चार कारकों है कि इस दृष्टिकोण की उपयोगिता को सीमित कर रहे हैं। धीमी गति से प्रसार और fixatives 7 की प्रतिक्रिया के कारण मिनट – सबसे पहले, लौकिक संकल्प कितनी जल्दी कोशिकाओं स्थिर किया जा सकता है, जो आम तौर रों लेता है द्वारा सीमित है। दूसरा, subcellular वास्तुकला मनाया जाता है पोस्ट कार्योत्तर 8; इस प्रकार, गतिशील रूपात्मक परिवर्तन इस दृष्टिकोण का उपयोग कर काटा नहीं जा सकता। तीसरा, प्रतिदीप्ति और इलेक्ट्रॉन micrographs ठीक ऊतक श की वजह से गठबंधन नहीं किया जा सकताइलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 9, 10 के लिए नमूना तैयारी के दौरान निर्जलीकरण की वजह से rinkage। चौथा, cytokinesis और endocytosis तरह की घटनाओं हर कोशिका 5, 11 में एक ही समय में जगह नहीं लेते हैं, और इस तरह, एक विशेष कक्ष है कि घटना में लगी हुई है कोशिकाओं की एक बड़ी आबादी से पहचान की जानी चाहिए। यह प्रक्रिया अक्सर श्रमसाध्य है। इस प्रकार, एक नई विधि हर कोशिका में विशेष घटनाओं के लिए प्रेरित करने और निर्धारित समय बिंदुओं पर कोशिकाओं का तेजी से स्थिरीकरण से जिसके परिणामस्वरूप सेलुलर गतिशीलता पर कब्जा करने के लिए आवश्यक है।
हाल ही में, कई उपकरण प्रकाश (optogenetics) का उपयोग विशेष रूप से सेलुलर गतिशीलता प्रेरित करने के लिए विकसित किया गया है। Channelrhodopsin, reinhardtii 12 Chlamydomonas से 13 अलग-थलग एक प्रकाश के प्रति संवेदनशील, गैर चयनात्मक कटियन चैनल है। जब channelrhodopsin neurona में व्यक्त किया हैएल झिल्ली, प्रकाश का एक संक्षिप्त फ़्लैश न्यूरॉन्स में सोडियम आयनों की एक बाढ़ लाती है और एक संभावित कार्रवाई 14, 15 से चलाता है। संभावित कार्रवाई तो synaptic टर्मिनल, जहां synaptic vesicles मिलीसेकेंड 16, 17 के भीतर फ्यूज, 18 इसलिए, channelrhodopsin न्यूरोनल गतिविधि को प्रेरित करता है में से प्रसारित। synaptic टर्मिनलों पर झिल्ली गतिशीलता का पालन करने के लिए, न्यूरॉन्स एमएस परिशुद्धता के साथ उत्तेजना के बाद निर्धारित समय बिंदुओं पर स्थिर किया जाना चाहिए।
न्यूरोनल गतिविधि उत्प्रेरण के बाद झिल्ली गतिशीलता पर कब्जा करने के लिए, हम उच्च दबाव ठंड 17, 18, 19 के साथ प्रकाश उत्तेजना मिलकर। उच्च दबाव ठंड कम बर्फ क्रिस्टल गठन 20 के साथ कोशिकाओं के पास तात्कालिक स्थिरीकरण के लिए अनुमति देता है। बर्फ के क्रिस्टल can झिल्ली टूटना और subcellular वास्तुकला 21 को बाधित। उत्तेजना और ठंड के बीच समय अंतराल अलग करके, synaptic टर्मिनलों के भीतर झिल्ली तस्करी एक संभावित कार्रवाई के शामिल होने निम्नलिखित कब्जा कर लिया था।
यहाँ, हम एक वाणिज्यीकरण उच्च दबाव फ्रीजर कि जोड़ों उच्च दबाव ठंड के साथ प्रकाश उत्तेजना की एक एमएस अस्थायी नियंत्रण का उपयोग प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का प्रदर्शन। अन्य उपकरणों है कि प्रकाश उत्तेजना और ठंड नियंत्रित करने के लिए एक बाह्य उपकरण की आवश्यकता के विपरीत, प्रकाश उत्तेजना पूरी तरह से इस प्रणाली में एकीकृत है और एमएस परिशुद्धता 19 के साथ लागू किया जा सकता। इस प्रक्रिया को कई चरण होते हैं। 1) माउस हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स नीलमणि डिस्क पर सभ्य और lentivirus channelrhodopsin 18 के लिए एक अभिव्यक्ति वेक्टर ले जाने से संक्रमित हैं। 2) न्यूरॉन्स को प्रेरित किया और उत्तेजना के बाद निर्धारित समय बिंदुओं पर जमे हुए हैं। 3) vitrified पानी विकल्प हैfixatives द्वारा एक कार्बनिक विलायक के साथ घ, जबकि लिपिड और प्रोटीन होते हैं पार से जुड़े intracellular वास्तुकला संरक्षित करने के लिए। 4) नमूने घुसपैठ की और epoxy राल में एम्बेडेड रहे हैं। 5) Ultrathin वर्गों एक ultramicrotome का उपयोग कर एकत्र कर रहे हैं। 6) पतला वर्गों एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप पर imaged कर रहे हैं। 7) छवि अधिग्रहण और विश्लेषण समय अंक या जीनोटाइप के संबंध में आँख बंद करके प्रदर्शन कर रहे हैं। सेलुलर गतिशीलता समय संकल्प लिया छवियों 17, 18 के पुनर्निर्माण के माध्यम से निर्धारित किया जा सकता। नमूना तैयारी (कदम 2 – 5 ऊपर) एक सप्ताह की आवश्यकता है, लेकिन बाद में छवि विश्लेषण एक वर्ष के लिए महीनों की आवश्यकता है।
"फ्लैश और फ्रीज" दृष्टिकोण optogenetics के साथ एक विशेष सेलुलर घटना उत्प्रेरण से और उत्तेजना 19 के बाद ठंड निर्धारित समय बिंदुओं पर कोशिकाओं द्वारा झिल्ली गतिशीलता की परिकल्पना करती। इस प्रदर्शन में, हम न्यूरॉन्स को प्रोत्साहित करने channelrhodopsin, एक प्रकाश के प्रति संवेदनशील कटियन चैनल का इस्तेमाल किया, और synaptic टर्मिनलों पर संलयन और synaptic vesicles की वसूली पर कब्जा कर लिया। हाल के वर्षों में कई optogenetic उपकरण 22, 23, जो सभी के फ्लैश और फ्रीज के साथ संगत कर रहे हैं विकसित किया गया है। उदाहरण के लिए, organelle तस्करी cryptochrome और CIB1 24 के आलोक प्रेरित heterodimerization का उपयोग कर प्रेरित किया जा सकता। इसी तरह, प्लाज्मा झिल्ली की लिपिड रचना प्लाज्मा झिल्ली से 25 phosphoinositide फास्फेटेजों के प्रकाश प्रेरित अनुवादन द्वारा बदला जा सकता। इसके अलावा, छोटे, प्रकाश के प्रति संवेदनशील azobenzene ch तरह यौगिकोंAnge रचना रोशनी तरंग दैर्ध्य पर निर्भर करता है। इस गठनात्मक परिवर्तन ligand-गेटेड चैनल सक्रिय करने के लिए या झिल्ली 26, 27 में लिपिड रचना को बदलने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। बंदी यौगिकों भी सेलुलर गतिविधि के लिए प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, मौजूदा सेटअप में इस्तेमाल किया एलईडी uncaging के लिए पर्याप्त ऊर्जा का उत्पादन नहीं कर सकते; इस प्रकार, प्रणाली के आगे अनुकूलन की संभावना जरूरी हैं। फिर भी, इन प्रकाश सक्रिय उपकरणों के अनुप्रयोगों लचीला-कई सेलुलर घटनाओं प्रकाश की एक फ्लैश द्वारा प्रेरित किया जा सकता है। "फ्लैश और फ्रीज" जिसके परिणामस्वरूप झिल्ली गतिशीलता पर कब्जा कर सकते हैं।
वहाँ "फ्लैश और फ्रीज" विधि के लिए दो मुख्य सीमाएं हैं। सबसे पहले, यह विभिन्न कोशिकाओं से एक विशेष घटना की "स्नैपशॉट" कैप्चर करता है। दूसरे शब्दों में, यह समय की अवधि में एक सेल में झिल्ली गतिशीलता का पालन करने के लिए संभव नहीं है। इस प्रकार, किसी सेलुलर के पुनर्निर्माण के लिए भीटी, एक को प्राप्त करने और प्रत्येक नमूने से और हर बार बिंदु पर छवियों की एक बड़ी संख्या का विश्लेषण करना चाहिए। इसके अलावा, न्यूरॉन्स में, छवियों के एक और भी बड़ी संख्या के लिए आवश्यक है, के बाद से synaptic vesicles के संलयन केवल 20 में स्थानों लेता है – माउस हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स 18, 28 में synapses के 30%। इतनी बड़ी डेटासेट के विश्लेषण के लिए समय की भारी मात्रा की आवश्यकता है। भविष्य में, छवि अधिग्रहण और विश्लेषण दृष्टिकोण और अधिक कुशल 29, 30 बनाने के लिए स्वचालित किया जा करने की जरूरत है।
दूसरी सीमा उच्च दबाव ठंड तकनीक की प्रकृति के द्वारा लगाया गया है। जब कोशिकाओं फ्रीज, सेलुलर पानी बर्फ के क्रिस्टल के रूप में करता है, तो ठंड दर से नीचे 100 कश्मीर / एस 21 है rearranges। ये बर्फ के क्रिस्टल झिल्ली घुसना या विलेय ध्यान केंद्रित स्थानीय आसमाटिक दबाव को बदलने के लिए, झिल्ली का टूटना, जिसके परिणामस्वरूप कर सकते हैं। बर्फ के क्रिस्टल से बचने के लिए, higज दबाव (~ 2,000 एटीएम) नमूनों के लिए लागू किया जाता है। सुपर शीतलन प्रभाव के कारण, 100 कश्मीर / s की ठंड दर इस दबाव 21 में बर्फ के क्रिस्टल के गठन से पानी को रोकने के लिए पर्याप्त है। सिद्धांत रूप में, के रूप में मोटी नमूनों के रूप में 500 सुक्ष्ममापी बर्फ के क्रिस्टल के बिना जमे हुए किया जा सकता है, लेकिन लगभग 200 सुक्ष्ममापी संभावना व्यावहारिक सीमा, के रूप में बर्फ के आयातफलकी रूपों मोटी ऊतक में फार्म के लिए करते हैं, है आकृति विज्ञान समझौता किए। जब प्रसंस्करण नमूने मोटा से अधिक 5 सुक्ष्ममापी, इस तरह के बीएसए के रूप में एक उचित क्रायो-protectant का उपयोग करते हैं, आवश्यक है। हालांकि, बीएसए समाधान की परासारिता बदल जाएगा और कोशिकाओं की शारीरिक प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकता। इसलिए, व्यापक नियंत्रण प्रयोगों विशेष प्रणालियों में बीएसए के उपयोग को मान्य करने के लिए आवश्यक हैं। बर्फ के क्रिस्टल उच्च दबाव ठंड के बाद अगर नमूनों गलती से तरल नाइट्रोजन स्नान से निकाल दिए जाते बना सकते हैं। इस प्रकार, यह हर समय तरल नाइट्रोजन में नमूनों रखने के लिए और करने के लिए पूर्व ठंडा संदंश का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण हैउन्हें हेरफेर।
जब प्रयोगों की योजना बना रहा है, तो निम्न तीन अंक माना जाना चाहिए। 8.0 मेगावाट / मिमी 2 – सबसे पहले, प्रकाश की अधिक से अधिक तीव्रता (460 एनएम लाइन) 5.5 है। क्या यह तीव्रता गतिविधि के लिए प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी फ्लैश और फ्रीज प्रयोगों से पहले पर लाइव सेल इमेजिंग के साथ सत्यापित किया जाना चाहिए। दूसरा, प्रयोगों शारीरिक तापमान पर किया जाना चाहिए। उच्च दबाव फ्रीजर के मंच माउस हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स 31 के साथ प्रयोग के लिए 37 डिग्री सेल्सियस को गरम किया जाता है। अंत में, समय अंक ध्यान से झिल्ली गतिशीलता पर कब्जा करने के लिए चुना जाना चाहिए। प्रारंभिक अध्ययन बताते endocytosis उत्तेजना के 100 एमएस के बाद पूरा हो गया है कि। इस प्रकार, तीन अतिरिक्त समय अंक (15, 30, और 50 एमएस) भी झिल्ली गतिशीलता 17, 18 का पालन करने के जांच की गई। ये समय अंक झिल्ली तस्करी घटना कल्पना करने के लिए आवश्यक थेअन्तर्ग्रथनी संचरण के दौरान। हालांकि, समय बिंदुओं की संख्या के लिए आवश्यकता प्रत्येक सेलुलर घटना में अलग हैं। इसलिए, कुछ समय अंक बड़े डाटासेट संग्रह शुरू करने से पहले नमूना किया जाना चाहिए।
The authors have nothing to disclose.
इस काम के जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय (दप) से धन द्वारा समर्थित किया गया। हम उनके तकनीकी सहायता के लिए चिकित्सा माइक्रोस्कोप सुविधा के जॉन्स हॉपकिन्स स्कूल धन्यवाद। हम तकनीक के विकास के लिए एरिक जॉर्गेन्सन और क्रिश्चियन रोजेनमंड और उनके प्रयोगशालाओं के सदस्यों को धन्यवाद। हम आरंभिक उपकरण के डिजाइन के लिए एम वायने डेविस धन्यवाद। हम उनके तकनीकी सहायता के लिए पॉल वुर्जिंगर, क्वेटा टोमोवा, और Delgermaa Luvsanjav धन्यवाद। हम यह भी पांडुलिपि के उनके महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए नेटली आर हैमिल्टन और ग्रैंट F कुसिक धन्यवाद।
Freeze Substitution and Low Temperature Embedding System for Light and Electron Microscopy -AFS II | Leica | ||
High Pressure Freezer – EM-ICE | Leica | EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing. | |
Osmometer | Gonotec | ||
Ultramicrotome UC7 | Leica | ||
Oven | Blue M | ||
Razor blade | Personna | ||
Glutaraldehyde | EMS | 16530 | |
Osmium tetroxide | EMS | RT19132 | Toxic, open only under certified chemical hood |
Acetone | EMS | RT10016 | |
HEPES | Emdmillipore | 391340-250GM | |
Glucose | Sigma | 49159-1KG | |
KCl | Sigma | 746436-1KG | |
NaCl | Sigma | S7653-1KG | |
CaCl2 | Sigma | 21115-250ML | |
MgCl2 | J.T.Baker | 2444-01 | |
Liquid epoxy resin Eponate 12 | Ted Pella | 18028 | |
Bisphenol A epoxy resin Araldite 502 | Ted Pella | 18028 | |
Dodecenyl succinic anhydride (DDSA) | Ted Pella | 18028 | |
Benzyl dimethyl amine (BDMA) | Ted Pella | 18241 | |
Special embedding (BEEM) capsule | EMS | 70021 | |
Copper Grid | Ted Pella | 1GC12H | |
Polyvinyl acetate (Pioloform F) | Ted Pella | 19244 | |
Uranyl acetate | Polysciences | 21447-25 | |
Ethyl cyanoacrylate (Super glue) | Scotch | 170497 | |
Trypsin-EDTA | Themo scientific | 25300-120 | |
DMEM | Thermo scientific | 10569-044 | Should be warmed at 37°C before use |
FBS | Thermo scientific | 26140-079 | |
Pen-Strep | Thermo scientific | 15140-122 | |
Fluoro-deoxyuridine (FUDR) | Sigma | F0503 | |
Glass cover slip | Fisher | S175223 | Should be acid-washed |
Sapphire disc | Technotrade | 616-100 | |
Acetic acid | Emdmillipore | 1000631011 | |
Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
Rat tail collagen | Thermo scientific | A10483-01 | |
Neurobasal A | Fisher | 10888022 | Should be warmed at 37°C before use |
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Fisher | 35050-079 | |
Seraum free supplement (B-27) | Fisher | 17504044 | |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo scientific | 24020117 | |
Papain | Worthington | LS003126 | Active Unit should be calculated for each batch |
Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer C | |
Trypsin inhibitor | Sigma | T9253 | |
NBQX | Tocris | 03-731-0 | |
Bicculine | Tocris | 01-091-0 | |
Whatman I filter paper | GE | ||
Transmission Electron Microscope | Philips CM20 |