Glycoproteomics من مصفوفة خارج الخلية: منهج في تحليل سكري سليمة عن طريق قياس الطيف الكتلي
Summary
وتصف هذه الورقة منهجية لإعداد عينات الأنسجة القلب والأوعية الدموية لتحليل MS التي تسمح لل(1) تحليل ECM تكوين البروتين، (2) تحديد مواقع بالغليكوزيل، و (3) توصيف التركيبي أشكال غليكان. هذه المنهجية يمكن تطبيقها، مع تعديلات طفيفة، لدراسة ECM في الأنسجة الأخرى.
Abstract
التليف هو السمة المميزة لكثير من الأمراض القلبية الوعائية ويرتبط إفراز استفحال وترسب المصفوفة خارج الخلية (ECM). استخدام البروتينات، حددنا سابقا أكثر من 150 ECM والبروتينات ECM المصاحب في أنسجة القلب والأوعية الدموية. والجدير بالذكر أن والغليكوزيلاتي العديد من البروتينات ECM. هذا التعديل بعد متعدية يؤثر البروتين للطي، والذوبان، ملزمة، وتدهور. لقد قمنا بتطوير الاستخلاص المتسلسل وطريقة تخصيب للبروتينات ECM التي تتوافق مع الطيف الكتلي السائل اللوني جنبا إلى جنب لاحقة تحليل (LC-MS / MS) من glycopeptides سليمة. وتقوم الاستراتيجية على حضانات متتابعة مع كلوريد الصوديوم، SDS لdecellularization الأنسجة، وهيدروكلوريد جوانيداين لإذابة البروتينات ECM. وتشمل التطورات الحديثة في LC-MS / MS طرق تجزئة، مثل مجموعات من الطاقة أعلى تصادم التفكك (HCD) ونقل الإلكترون التفكك (المفتشون)، والتي تسمح للالتحليل التركيبي المباشر للglycopeptides من البروتينات ECM. في هذه الورقة، ونحن تصف طريقة لإعداد ECM من عينات الأنسجة. طريقة يسمح ليس فقط لتحديد ملامح البروتين ولكن أيضا تقييم وتوصيف ارتباط بالغليكوزيل عن طريق تحليل MS.
Introduction
التليف هو السمة المميزة لكثير من الأمراض. الليفية تتكاثر وتفرق نحو الظواهر التركيبية للغاية، والتي ترتبط مع إفراز استفحال وترسب المصفوفة خارج الخلية (ECM) 1. الإفراط ECM ترسب يمكن أن تستمر، حتى بعد أن خفت حدة الإصابة الأولية، مما يؤدي إلى اضطراب وظيفي. استخدام البروتينات، حددنا سابقا أكثر من 150 ECM والبروتينات ECM المصاحب في أنسجة القلب 2 و 3. فهي ليست الوحيدة البروتينات الهيكلية، ولكن أيضا البروتينات matricellular والبروتياز التي تساهم في إعادة المستمر والتكيف الحيوي من القلب. والجدير بالذكر أن والغليكوزيلاتي العديد من البروتينات ECM 4. هذا التعديل بعد متعدية (PTM) ينطوي على إضافة مخلفات السكر لبعض المواقف من الأحماض الأمينية، وأنه يؤثر على البروتين للطي، والذوبان، ملزمة، وتدهور 5 </sتصل>.
هناك نوعان بالغليكوزيل الرئيسية التي تحدث في الثدييات. (1) يحدث N-بالغليكوزيل في النيتروجين carboxamido من بقايا الأسباراجين (الأسباراجين) ضمن تسلسل إجماع الأسباراجين-XAA-منتدى المجالس الرومانسية / سر، حيث XAA هو أي حمض أميني باستثناء البرولين. (2) في O-بالغليكوزيل، وبقايا السكر نعلق على سيرين وثريونين بقايا (سر، منتدى المجالس الرومانسية) أو، إلى حد أقل بكثير، لالهيدروكسي برولين وهيدروكسي ليزين. في حين يمكن أن يحدث O-بالغليكوزيل في مجموعة متنوعة من الجماعات البروتين، يتم تقييد N-بالغليكوزيل للبروتينات يفرز أو المجالات خارج الخلية من بروتينات الغشاء 5. وهذا يجعل N-بالغليكوزيل هدفا جذابا عند دراسة ECM.
يحدد البروتينات معيارا جديدا لتحليل التغيرات البروتين في المرض. حتى الآن، وقد ركزت الدراسات معظم البروتينات على البروتينات داخل الخلايا 6. ويرجع ذلك أساسا إلى الأسباب التالية هذا. أولا، البروتينات داخل الخلايا وفيرة تعيق للهوية منذfication مكونات ECM الشحيحة. هذا أمر بالغ الأهمية ولا سيما في أنسجة القلب، والتي تشكل الميتوكوندريا وخيط عضلي البروتينات لنسبة كبيرة من البروتين 7. ثانيا، البروتينات ECM متكامل هي عبر مرتبطة بشكل كبير ويصعب إذابة. وأخيرا، فإن وجود وفرة PTMs (أي بالغليكوزيل) يغير الكتلة الجزيئية، وتهمة، وخصائص الكهربي من الببتيدات، مما يؤثر على فصل وتحديد من السائل اللوني جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (LC-MS / MS). خلال السنوات الأخيرة، قمنا بتطوير وتحسين استخراج متتابعة وطريقة تخصيب للبروتينات ECM التي تتوافق مع تحليل لاحقة مطياف الكتلة (MS). وتقوم الاستراتيجية على حضانات متسلسلة.
يتم تنفيذ الخطوة الأولى مع كلوريد الصوديوم، وجود مخزن مؤقت الأيونية التي تسهل استخراج البروتينات المرتبطة ECM وECM ملزمة فضفاضة، وكذلك البروتينات ECM توليفها حديثا. هو أناالصورة المنظفات مجانا، غير تغيير طبيعة، غير مدمرة لأغشية الخلايا، وقابلة لمزيد من فحوصات البيوكيميائية 8. ثم، ويتحقق decellularization مع كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS). في هذه الخطوة، تركيز منخفض SDS يضمن زعزعة استقرار الغشاء والإفراج عن البروتينات داخل الخلايا ويمنع تعطيل مكونات ECM غير المدمجة أكثر قابلية للذوبان. وأخيرا، يتم استخراج البروتينات ECM مع العازلة جوانيداين هيدروكلوريد (GuHCl). GuHCl فعال في استخراج البروتينات والبروتيوغليكان بشكل كبير عبر ربط من الأنسجة مثل الأوتار 9 والغضاريف 10، سفن 11 و 12 و 13 و قلب 2 و 3. طبقنا هذا تجزئة الكيمياء الحيوية، في تركيبة مع LC-MS / MS، لاستكشاف إعادة عرض ECM في أمراض القلب والشرايين 2 <sup> و 3 و 11 و 12 و 13 و 14. وتشمل التطورات الحديثة في أساليب MS تجزئة جديدة، مثل مجموعات من الطاقة أعلى تصادم التفكك (HCD) ونقل الإلكترون التفكك (المفتشون)، والتي تسمح للتحليل المباشر للglycopeptides سليمة 3، 15.
نحن هنا وصف منهجية لإعداد ECM لتحليل MS التي تسمح لتحليل تكوين البروتين، وتحديد مواقع بالغليكوزيل، وتوصيف أشكال غليكان. بالمقارنة مع التحليلات السابقة من ECM بالغليكوزيل 16، هذه المنهجية تسمح للتقييم المباشر للتغيرات التركيبية في لمحات بالغليكوزيل بطريقة محددة الموقع باستخدام MS. لقد طبقت هذه المنهجية لأنسجة القلب والأوعية الدموية. ومع ذلك، فإنه يمكن اللهذلك أن تطبق، مع تعديلات طفيفة، لدراسة ECM في عينات الأنسجة الأخرى، ويمكن تقديم رؤى غير مسبوقة في علم الأحياء ECM.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تم تحسين هذا البروتوكول البروتينات على مدى السنوات القليلة الماضية في مختبرنا. هنا، كنا أنسجة القلب، ولكن قد تكون هناك حاجة فقط تعديلات طفيفة لتطبيقه على الأنسجة الأخرى. على سبيل المثال، يحتاج بروتوكول استخراج لاتخاذ الخلوية للنسيج في الاعتبار. الأنسجة القلبية هي الخلوية للغاية بالمقارنة مع الأنسجة الوعائية. عند استخدام الأنسجة الوعائية، يمكن للتركيز SDS يكون أقل (أي 0،08٪)، والوقت decellularization هو أقصر (أي 4 ح) 11، 12، 13. استخدام الإنزيمات deglycosylation هو أمر حاسم لتحليل LC-MS / MS التكوين ECM. ومع ذلك، يجب أن يتم تعديلها لأنواع الأنسجة المختلفة الأوقات الحضانة. على سبيل المثال، heparinase II المطلوبة مرات حضانة تمتد على 25 ° C عند استخدام عينات مثل الجلد، والتي هي غنية في البروتينات الغشاء القاعدي (على سبيل المثال أجرين AGRIN، perlecan) (لا تظهر البيانات). يمكن إجراء تحليل سكري مباشر على وسائل الاعلام مشروط من الخلايا في الثقافة (15). قد لا تكون هناك حاجة خطوات تخصيب اليورانيوم لتحليل هذه subproteome المبسطة. على غرار مقتطفات GuHCl وعصائر كلوريد الصوديوم هي أيضا قابلة للتحليل glycoproteomics مع تعديلات طفيفة. بروتوكولات استخراج أخرى لتخصيب اليورانيوم من البروتينات ECM يمكن تكييفها لتوصيف glycopeptides ECM 19 و 20.
بالغليكوزيل هو PTM الأكثر تعقيدا 5. ويتحقق تحديد غير مباشر من glycopeptides من قبل الكشف عن deamidated الأسباراجين مع دمج 18 O في NXT / S sequon. Deamidated الأسباراجين في مواقف أخرى قد تمثل ايجابيات كاذبة. وبالمثل، يجب النظر N-بالغليكوزيل في سياق تجميعات البروتين: والبروتينات داخل الخلايا التي تحتوي على NXT / S sequon لا يمكن الغليكوزيلاتي ولكن قد تؤدي إلى ايجابيات كاذبة. كما البحث في الانترنت الحاليةخوارزميات ح لا تسمح لفحص PTMs في تسلسل محددة مسبقا فقط (أي الأسباراجين في NXT / S)، مطلوب تصفية اليدوي للبيانات. تحديد وجود / غياب بالغليكوزيل في هذه المواقف يمكن مقارنة بين عينات من الأمراض ومكافحتها. ليس هناك ما يعادلها انزيم لPNGase F لO-deglycosylation (أي إدخال التحول الشامل على ثريونين أو سيرين). لذلك، يتم تقييد تحديد O-بالغليكوزيل لتحليل سكري المباشر. ويستخدم تحليل سكري المباشر للحصول على معلومات التركيبية من السكريات تعلق على البروتينات، ولكن لا توفر المعلومات الهيكلية للغليكان. وعلاوة على ذلك، وتكوين غليكان هو نتيجة لتركيب غليكان وتجهيز بعد إفراز.
وقد سمح لنا طريقة استخراج 3 خطوات للبروتينات ECM ( "الانجليزية خطوة سريعة") 6 تميز ECM في مجموعة متنوعة من أنسجة القلب والأوعية الدموية. تجزئة النسيجإلى عدة مقتطفات مطلوب للحصول على بروتيوم ECM مبسط كما نوقش في أي مكان آخر 6. أن البروتينات داخل الخلايا يساهم ذلك إلى مجموعة ديناميكية المفرط للتركيزات البروتين داخل مقتطفات من شأنها أن تعيق تحديد البروتينات ECM أقل وفرة. وعلاوة على ذلك، والبروتينات داخل الخلايا تحمل O-glycosylations 5 التي من شأنها تعقيد ECM تخصيب سكري وتحليل MS احق. مؤلفين آخرين تطبيق منهجيات استخراج مماثلة لوصف على سبيل المثال الرئة 21 و أنسجة الغضروف 10، إلا أنها لم يتابع تحليل بالغليكوزيل. التحليل السابق لبالغليكوزيل تركز على تحديد glycosites فقط، تتطلب إزالة غليكان من صميم البروتين، ولا يمكن تقييم O-بالغليكوزيل 22 و 23. صفائف كتين وإثراء الكيميائية المتاحة للتقييم من الطرق والجسور غليكانوفاق على عينات بيولوجية تعتمد على خصوصية ملزمة، ولكن لا يمكن لهذه التقنيات تعيين أنواع غليكان إلى بروتينات معينة 24 ولا يستطيعون تقييم المواقع بالغليكوزيل.
في البداية، كنا هلام الكهربائي قبل LC-MS / MS من البروتينات ECM. على الرغم من أن فصل هلام مفيد في الحصول على أجزاء البروتين مبسطة قابلة للتحليل LC-MS / MS، أحدث الأدوات توفر سرعة المسح الضوئي بسرعة. وهكذا، فإن الخطوة الفصل الكهربي يمكن حذفها. وهذا يوفر ميزة إضافية كما يتم تحليل البروتينات ECM الكبيرة، والتي يتم الاحتفاظ بها على رأس هلام، وأكثر كفاءة. ومع ذلك، يتم فقدان المعلومات المتعلقة ميغاواط من البروتينات سليمة. الخطوة تبخر قبل PNGase F deglycosylation يضمن إزالة كاملة من العادي H 2 O للحد من السلبيات كاذبة. بقايا السكر (أي الجماهير غليكان متغير) تتداخل مع الفاصل LC وسطا تحديد الببتيد لاحق من قبل MS / MS. A صوأوصت-deglycosylation البروتوكول أيضا لتحليل البروتينات البروتينات ECM لا تركز على بالغليكوزيل.
يمكن أن البروتينات تقدم رؤى غير مسبوقة في ECM. ما وراء الدعم الهيكلي، glycans تعلق على ECM ضرورية للتفاعل المضيف الممرض والاتصالات خلية خلية والاستجابة المناعية 25، أي المزروع الرفض بعد زرع الأعضاء. سوف Glycoproteomics يكون أداة أساسية في غليكوبيولوغي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JBB هو زميل مؤسسة الوظيفي في مركز الملك القلب البريطانية مؤسسة. MM هو زميل أقدم في مؤسسة القلب البريطانية (FS / 13/2/29892). وأيد هذه الدراسة من قبل مبادرة التميز (مراكز الكفاءة لتقنيات ممتازة – COMET) من الوكالة النمساوية تعزيز البحوث FFG: "مركز أبحاث التميز في الأوعية الدموية الشيخوخة – تيرول، VASCage" (رقم مشروع K 843536) وبحوث الطبية الحيوية NIHR مركز مقرها في مؤسسة الخدمات الصحية الصندوق الوطني غاي وسانت توماس "وكينجز كوليدج لندن في شراكة مع مستشفى كينجز كوليدج.
Materials
| A. Chemicals | |||
| Acetonitrile, MS-grade (ACN, C2H3N) | Thermo Scientific | 51101 | 5.2-5.8, 6.2, 7.11, Supp 2, 3, 4 |
| Cocktail of proteinase inhibitors | Sigma-Aldrich | P8340 | 1.3, 1.4.1, 1.5.1, 1.6.1 |
| Disodium phosphate (Na2H2PO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | 3.1 |
| Dithiotreitol (DTT, C4H10O2S2) | Sigma-Aldrich | D0632 | 4.3 |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, C10H16N2O8) | Sigma-Aldrich | E9884 | 1.3, 1.4.1, 1.5.1, 1.6.1 |
| Ethanol (C2H6O) | VWR | 437433T | 2.2.1 |
| Guanidine hydrochloride (GuHCl, CH6ClN3) | Sigma-Aldrich | G3272 | 1.6.1 |
| Glycerol (C3H8O3) | Acros organics | 158920025 | Suppl 1.1 |
| H2O LC-MS Cromasolv | Sigma-Aldrich | 39253-1L-R | Throughout the protocol |
| H218O | Taiyo Nippon Sanso | FO3-0027 | 3.5 |
| Hydroxylamine (HA, H3NO) | Sigma-Aldrich | 467804 | 6.4 |
| Iodoacetamide (IAA, C2H4INO) | Sigma-Aldrich | A3221 | 4.4 |
| Phosphate-buffered Saline (PBS), 10X | Lonza | 51226 | 1.3 |
| Sodium acetate (C2H3NaO2) | Sigma-Aldrich | S7545 | 1.6.1 |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | 1.4.1, 3.2 |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS, NaC12H25SO4) | Sigma-Aldrich | 466143 | 1.5.1 |
| Triethylammonium bicarbonate (TEAB, C7H17NO3) | Sigma-Aldrich | 11268 | 4.7, 6.1 |
| Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) | Sigma-Aldrich | T62200 | 4.8, 5.2-5.8, 7.11, Supp 2, 3 |
| Thiourea (CH4N2S) | Sigma-Aldrich | T8656 | 4.2 |
| Tris-hydrochloride (Tris-HCl, NH11C4O3[HCl]) | Sigma-Aldrich | T3253 | 1.4.1, Suppl 1. |
| Urea (CH4N2O) | Sigma-Aldrich | U1250 | 4.2 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B. Enzymes | |||
| α2-3,6,8,9-Neuraminidase (Sialidase) | EDM Millipore | 362280 (KP0012) | 3.1 |
| β1,4-Galactosidase | EDM Millipore | 362280 (KP0004) | 3.1 |
| β-N-Acetylglucosaminidase | EDM Millipore | 362280 (KP0013) | 3.1 |
| Chondroitinase ABC | Sigma-Aldrich | C3667 | 3.1 |
| Endo-α-N-acetylgalactosaminidase (O-glycosidase) | EDM Millipore | 362280 (KP0011) | 3.1 |
| Heparinase II | Sigma-Aldrich | H6512 | 3.1 |
| Keratanase | Sigma-Aldrich | G6920 | 3.1 |
| PNGase-F (N-Glycosidase F) | EDM Millipore | 362280 (KP0001) | 3.5 |
| Trypsin | Thermo Scientific | 90057 | 4.7 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. Reagent kits | |||
| 30 kDa MWCO spin filters | Amicon, Millipore | 10256744 | 5.9, Suppl 2 |
| Macro SpinColumn C-18, 96-Well Plate | Harvard Apparatus | 74-5657 | 5.1 |
| NuPAGE Novex BisTris Acrylamide Gels | Thermo-Scientific | NP0322PK2 | Suppl 1 |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | 2.1.3 |
| ProteoExtract Glycopeptide Enrichment Kit | Merk Millipore | 72103 | 7 |
| Tandem mass tag 0 (TMT0) | Thermo Scientific | 900067 | 6.2, 6.3 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D. Equipment and software | |||
| Acclaim PepMap100 C18 Trap, 5mm x 300µm, 5µm, 100Å | Thermo Scientific | 160454 | Suppl 3, 4 |
| Acclaim PepMap100 C18, 50cm x 75µm, 3µm, 100Å | Thermo Scientific | 164570 | Suppl 3 |
| Byonic Search Engine | Protein Metrics | Version 2.9.30 | Suppl 5 |
| Dionex UltiMate 3000 RSLCnano | Thermo Scientific | n/a | Suppl 3, 4 |
| EASY-Spray Ion Source | Thermo Scientific | ES081 | Suppl 4 |
| EASY-Spray PepMap RSLC C18, 50cm x 75µm, 2μm, 100Å | Thermo Scientific | ES803 | Suppl 4 |
| Mascot Search Engine | Matrix Science | Version 2.3.01 | Suppl 3 |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | Suppl 4 |
| Proteome Discoverer Software | Thermo Scientific | Version 2.1.1.21 | Suppl 3, 5 |
| Picoview Nanospray Source | New Objective | 550 | Suppl 3 |
| Q Exactive HF Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | Suppl 3 |
| Savant SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific | SPD131DDA | 2.2.2, 3.4, 4.6, 5.7, 6.5, 7.11 |
| Scaffold Software | Proteome Software | Version 4.3.2 | Suppl 3 |
References
- Porter, K. E., Turner, N. A. Cardiac fibroblasts: at the heart of myocardial remodeling. Pharmacol. Ther. 123 (2), 255-278 (2009).
- Barallobre-Barreiro, J., et al. Proteomics analysis of cardiac extracellular matrix remodeling in a porcine model of ischemia/reperfusion injury. Circulation. 125 (6), 789-802 (2012).
- Barallobre-Barreiro, J., et al. Glycoproteomics reveals decorin peptides with anti-myostatin activity in human atrial fibrillation. Circulation. 134 (11), 817-832 (2016).
- Lynch, M., Barallobre-Barreiro, J., Jahangiri, M., Mayr, M. Vascular proteomics in metabolic and cardiovascular diseases. J. Intern. Med. 280 (4), 325-338 (2016).
- Varki, A., Lowe, J. B., Varki, A. Biological Roles of Glycans. Essentials of glycobiology. 2nd ed. , (2009).
- Barallobre-Barreiro, J., Lynch, M., Yin, X., Mayr, M. Systems biology – opportunities and challenges: The application of proteomics to study the cardiovascular extracellular matrix. Cardiovasc. Res. , (2016).
- Agnetti, G., Husberg, C., Van Eyk, J. E. Divide and conquer: the application of organelle proteomics to heart failure. Circ. Res. 108 (4), 512-526 (2011).
- Mason, R. M., Mayes, R. W. Extraction of cartilage protein-polysaccharides with inorganic salt solutions. Biochem. J. 131 (13), 535-540 (1973).
- Vogel, K. G., Peters, J. A. Isolation of proteoglycans from tendon. Methods. Mol. Biol. 171, 9-17 (2001).
- Wilson, R., et al. Comprehensive profiling of cartilage extracellular matrix formation and maturation using sequential extraction and label-free quantitative proteomics. Mol. Cell. Proteomics. 9 (6), 1296-1313 (2010).
- Barallobre-Barreiro, J., et al. Extracellular matrix remodeling in response to venous hypertension: proteomics of human varicose veins. Cardiovasc. Res. 110 (3), 419-430 (2016).
- Didangelos, A., Yin, X., Mandal, K., Baumert, M., Jahangiri, M., Mayr, M. Proteomics characterization of extracellular space components in the human aorta. Mol. Cell. Proteomics. 9 (9), 2048-2062 (2010).
- Didangelos, A., et al. Extracellular matrix composition and remodeling in human abdominal aortic aneurysms: a proteomics approach. Mol. Cell. Proteomics. 10 (8), (2011).
- Grandoch, M., et al. Loss of biglycan enhances thrombin generation in apolipoprotein E-deficient mice: Implications for inflammation and atherosclerosis. Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. 36 (5), e41-e50 (2016).
- Yin, X., Bern, M., Xing, Q., Ho, J., Viner, R., Mayr, M. Glycoproteomic analysis of the secretome of human endothelial cells. Mol. Cell. Proteomics. 12 (4), 956-978 (2013).
- Parker, B. L., et al. Quantitative N-linked glycoproteomics of myocardial ischemia and reperfusion injury reveals early remodeling in the extracellular environment. Mol. Cell. Proteomics. 10 (8), (2011).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Pepinsky, R. B. Selective precipitation of proteins from guanidine hydrochloride-containing solutions with ethanol. Anal. Biochem. 195 (1), 177-181 (1991).
- de Castro-Brás, L. E., et al. Texas 3-step decellularization protocol: looking at the cardiac extracellular matrix. J. Proteomics. 86, 43-52 (2013).
- Naba, A., Clauser, K. R., Hynes, R. O. Enrichment of extracellular matrix proteins from tissues and digestion into peptides for mass spectrometry analysis. J Vis Exp. (101), e53057 (2015).
- Decaris, M. L., et al. Proteomic analysis of altered extracellular matrix turnover in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Mol. Cell. Proteomics. 13 (7), 1741-1752 (2014).
- Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry. Nat. Biotechnol. 21 (6), 660-666 (2003).
- Parker, B. L., et al. Site-specific glycan-peptide analysis for determination of N-glycoproteome heterogeneity. J. Proteome Res. 12 (12), 5791-5800 (2013).
- Li, Y., et al. Simultaneous analysis of glycosylated and sialylated prostate-specific antigen revealing differential distribution of glycosylated prostate-specific antigen isoforms in prostate cancer tissues. Anal. Chem. 83 (1), 240-245 (2011).
- Rienks, M., Papageorgiou, A. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial extracellular matrix: an ever-changing and diverse entity. Circ. Res. 114 (5), 872-888 (2014).
