Glycoproteomics der extrazellulären Matrix: eine Methode zur Intact Glycopeptidthioestern Analyse unter Verwendung von Massenspektrometrie

Summary

Dieses Papier beschreibt eine Methodik kardiovaskuläre Gewebeproben für die MS-Analyse herzustellen, das für (1) die Analyse der Proteinzusammensetzung ECM ermöglicht, (2) die Identifizierung von Glykosylierungsstellen, und (3) der Zusammensetzungs Charakterisierung von Glycan Formen. Diese Methodik kann mit geringfügigen Modifikationen angewandt wird, zum Studium des ECM in anderen Geweben.

Abstract

Fibrose ist ein Kennzeichen vieler Krankheiten, Herz-Kreislauf und mit der verschärft Sekretion und Ablagerung der extrazellulären Matrix (ECM) zugeordnet ist. Mit Proteomik, wir haben bisher mehr als 150 ECM identifiziert und ECM-assoziierten Proteine ​​in kardiovaskulären Geweben. Bemerkenswerterweise sind viele ECM-Proteine ​​glycosyliert. Diese posttranslationale Modifikation betrifft die Proteinfaltung, die Löslichkeit, Bindung und Abbau. Wir haben eine sequentielle Extraktion und Anreicherungsverfahren für ECM-Proteine ​​entwickelt, die mit der anschließenden Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS / MS) Analyse von intaktem Glycopeptide kompatibel ist. Die Strategie beruht auf sequentielle Inkubationen mit NaCl, SDS für Gewebe Dezellularisierung und Guanidinhydrochlorid zur Solubilisierung von ECM-Proteinen. Jüngste Fortschritte in der LC-MS / MS-Fragmentierungsverfahren umfassen, wie beispielsweise Kombinationen von hochenergetischen Kollision Dissoziation (HCD) und Elektronentransfer-Dissoziation (ETD), die es erlauben, fürdie direkte Zusammensetzungsanalyse von Glycopeptiden von ECM-Proteinen. In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir eine Methode, um die ECM aus Gewebeproben vorzubereiten. Das Verfahren ermöglicht nicht nur für die Proteinprofilierung, sondern auch die Bewertung und Charakterisierung der Glykosylierung durch MS-Analyse.

Introduction

Fibrosis ist ein Kennzeichen vieler Krankheiten. Fibroblasten proliferieren und differenzieren sich zu hoch synthetischen Phänotypen, die mit der verschärft Sekretion und Ablagerung von extrazellulärer Matrix (ECM) ¹ verbunden sind. Übermäßige ECM Ablagerung kann fortgesetzt werden, auch nach der anfänglichen Verletzung abgeklungen ist, zu Funktionsstörungen führen. Verwendung von Proteomics, haben wir bisher mehr als 150 ECM identifiziert und ECM-assoziierten Proteine in dem Herzgewebe ^{2, 3.} Sie sind nicht nur strukturelle Proteine, sondern auch matrizelluläre Proteine ​​und Proteasen, die zum kontinuierlichen Umbau und dynamische Anpassung des Herzens beitragen. Bemerkenswerterweise sind viele ECM Proteine glykosyliert ^4. Diese posttranslationale Modifikation (PTM) beinhaltet die Zugabe von Zuckerresten an bestimmten Positionen Aminosäure, und es betrifft die Proteinfaltung, die Löslichkeit, Bindung und Abbau ⁵ </sup>.

Es gibt zwei Haupttypen, die Glykosylierung bei Säugetieren vorkommen. (1) N-Glycosylierung tritt an der carboxamido Stickstoff von Asparaginreste (Asn) in der Konsensussequenz Asn-Xaa-Thr / Ser, wobei Xaa eine beliebige Aminosäure mit Ausnahme von Prolin. (2) In-O-Glykosylierung, schließen Zuckerreste an Serin und Threonin-Reste (Ser, Thr), oder in einem viel geringeren Ausmaß, und Hydroxylysin Hydroxyprolin. Während der O-Glykosylierung in einer Vielzahl von Proteingruppen auftreten kann, ist die N-Glykosylierung ⁵ bis sekretierten Proteine oder extrazellulären Domänen von Membranproteinen beschränkt. Dies macht die N-Glykosylierung ein attraktives Ziel, wenn das ECM zu studieren.

Proteomics setzt einen neuen Standard für die Analyse von Proteinveränderungen in Krankheit. Bisher haben die meisten Proteomstudien auf intrazelluläre Proteine ⁶ konzentriert. Dies ist im Wesentlichen auf den folgenden Gründen. Erstens behindern reichlich vorhandenen intrazellulärer Proteine, die identifizierung der knappen ECM-Komponenten. Dies ist besonders wichtig im Herzgewebe, bei dem mitochondrialen und myofilament Proteine machen einen großen Anteil an dem Proteingehalt ^7. Zweitens sind integrale ECM-Proteine ​​stark vernetzt und schwierig zu lösen. Schließlich ändert die Anwesenheit von reichlich PTMs (dh Glykosylierung) , um die molekulare Masse, Ladung und elektrophoretische Eigenschaften von Peptiden, die beide um die Trennung und die Identifizierung durch Flüssigchromatographie – Tandem – Massenspektrometrie (LC-MS / MS) zu beeinträchtigen. In den letzten Jahren haben wir entwickelt und verbessert, um eine sequentielle Extraktion und Anreicherungsverfahren für ECM-Proteine, die mit anschließender Massenspektrometrie (MS) Analyse kompatibel ist. Die Strategie basiert auf sequentielle Inkubationen.

Der erste Schritt wird mit NaCl, einem ionischen Puffer durchgeführt, die die Extraktion von ECM-assoziierter und losen gebundenen ECM-Proteinen sowie neu synthetisierte ECM Proteine ​​erleichtern. Es is Reinigungsmittel – freie, nicht-denaturierenden, unterbrechungs von Zellmembranen und zugänglich für weitere biochemische Assays ^8. Dann wird Dezellularisierung mit Natriumdodecylsulfat (SDS) gelöst. Bei diesem Schritt sorgt für eine geringe Konzentration SDS Membrandestabilisierung und die Freisetzung von intrazellulären Proteinen, während der Unterbrechung der löslicheren nicht integralen ECM-Komponenten zu verhindern. Schließlich ECM-Proteine ​​sind mit einem Guanidinhydrochlorid-Puffer (GuHCl) extrahiert. GuHCl ist wirksam bei der Extraktion von stark vernetzten Proteinen und Proteoglykane von Geweben wie Sehnen ^9, Knorpel ^10, Behälter ^{11, 12, 13} und das Herz ^{2, 3.} Wir wandten diese biochemische Fraktionierung in Verbindung mit LC-MS / MS, ECM Umgestaltung in kardiovaskulären Erkrankungen ² zu erkunden <sup>, ^{3, 11, 12, 13, 14.} Jüngste Fortschritte in der MS umfassen neuartige Fragmentierungsverfahren, wie beispielsweise Kombinationen von hochenergetischen Kollision Dissoziation (HCD) und Elektronentransfer – Dissoziation (ETD), die für die direkte Analyse von intaktem Glycopeptide ^{3, 15} ermöglichen.

Hier beschreiben wir eine Methode zur ECM für MS-Analyse vorzubereiten, die für die Analyse der Proteinzusammensetzung ermöglicht es, die Identifizierung von Glykosylierungsstellen, und der Charakterisierung von Glycan Formen. Im Vergleich zu früheren Analysen von ECM Glykosylierung ¹⁶ ermöglicht diese Methodik für die direkte Beurteilung der Veränderungen in der Zusammensetzung in Glycosylierungsprofilen in einer ortsspezifischen Weise MS verwenden. Wir haben diese Methode auf kardiovaskulärem Gewebe angewendet. Er kann jedoch also angewandt wird, mit geringfügigen Modifikationen, um die Untersuchung des ECM in anderen Gewebeproben und noch nie dagewesene Einblicke in ECM biology bieten kann.

Protocol

und erhielt institutionelle Zustimmung von dem Forschungs- und Entwicklungsbüro: Die Studie wurde von der Wandsworth Lokale Forschungsethikkommission (06 / Q0803 / 37 Referenznummer) genehmigt. Alle Patienten gaben informierte Zustimmung geschrieben. 1. Extraktion von extrazellulären Matrixproteinen HINWEIS: Die menschlichen Vorhofgewebe für diese Experimente verwendet wurden von den Herzohren während der kardiopulmonalen Bypass erhalten, kurz nach der kardioplegischen Verhaftung des Herzens. Alle Proben wurden in der St.-Georgs-Hospital, London, UK gesammelt. Alle Gewebeproben müssen bei -80 ° C eingefroren werden. verwendet keine Proben konserviert mit Fixiermitteln, wie Paraformaldehyd, dass Proteine ​​zu. Bereiten Sie alle Extraktionspuffer im voraus von Experimenten, gemäß Tabelle 1, um die Zeit zwischen den Extraktionsstufen zu minimieren. Führen Sie alle Inkubationen bei Raumtemperatur (RT) in einer temperaturgeregelten Umgebung(Dh ~ 20 ° C) Konsistenz zwischen den Extraktionen zu gewährleisten. Wiegen 20-50 mg Gewebe. Wenn mehrere Proben zu extrahieren sind, schneiden und wiegen sie eins nach dem anderen die vollständige Auftauen des Gewebes zu vermeiden. Unter Verwendung eines Skalpells, Würfel das Gewebe in kleinere Stücke 3-4 (dh 2-3 mm) und legt sie zusammen in 1,5 – ml – Röhrchen. In 500 ul eiskalter phosphatgepufferter Salzlösung (PBS; siehe Tabelle 1 und die Tabelle der Materialien) und führen fünf Wäschen Blutkontamination zu minimieren. Extraktionsschritt 1: Die Inkubation mit NaCl – Puffer Nach Waschen mit PBS, legen Sie die Proben in 1,5 ml-Röhrchen mit Schraubverschluss. In NaCl-Puffer (siehe Tabelle 1) bei 10 – mal (v: w) dem Gewicht Gewebe. Vortex die Röhrchen bei RT für 1 h bei Mindestdrehzahl (dh, 600 rpm). HINWEIS: Eine niedrige Wirbelgeschwindigkeit ist entscheidend, um die mechanische Zerstörung des Gewebes während dieses Schrittes zu vermeiden.Verwenden, um einen Schaum Adapter alle Röhrchen während der Extraktion zu platzieren. Überträgt die Extrakte in neue Röhrchen und Zentrifugieren bei 16.000 xg für 10 min bei 4 ° C. Lagern Sie die Extrakte bei -20 ° C bis zur Verwendung. Kurz Waschpuffer die restlichen Gewebepellets mit frischem NaCl. Verwendet den gleichen Typen von Puffern (dh 100 & mgr; l NaCl – Puffer) zum Waschen der Extraktion anderer Proteine mit unterschiedlichen Löslichkeiten (dh Proteinen nicht extrahierbar mit NaCl) zu verhindern. Nach dem Waschen gewährleistet die vollständige Entfernung des Puffers Überlappung in Proteingehalt mit anschließenden Extraktionsschritten zu minimieren. Verwerfen Sie den NaCl-Puffer zum Waschen verwendet. HINWEIS: Das Verhältnis zwischen dem Puffervolumen und Gewebegewicht ist wichtig für eine reproduzierbare Extraktion. Ein 10: 1-Verhältnis (v: w) für die SDS und NaCl-Extraktionen und 5: 1 für den Schritt GuHCl ausreichende Mengen an Protein bereitzustellen, ohne den Puffer zu sättigen. Die Proteinkonzentrationen sind etwa 1-2 ug / ul nach extraction. Extraktionsschritt 2: Dezellularisierung mit SDS – Puffer Hinzufügen SDS – Puffer (Tabelle 1) bei zehn Mal (v: w) , um das Gewebegewicht; die Verwendung von niedrigeren SDS – Konzentrationen (dh 0,1%) ist entscheidend , um den Verlust von ECM – Proteinen während der Dezellularisierung zu vermeiden. Vortex die Röhrchen bei RT für 16 h bei Mindestdrehzahl (dh, 600 rpm). HINWEIS: Eine niedrige Wirbelgeschwindigkeit mechanische Störung des ECM minimiert. Übertragen Sie die Extrakte in neue Röhrchen. Zentrifuge bei 16.000 xg für 10 min bei 4 ° C; Lagerung bei -20 ° C bis zur Verwendung. Kurz wasche die verbleibenden Gewebepellets mit dd H 2 O , um das SDS zu entfernen. Sicherstellen, dass die vollständige Entfernung der Flüssigkeit nach dem Waschen. Extraktion Schritt 3: Inkubation mit GuHCl Puffer In GuHCl Puffer (Tabelle 1) zu fünfmal (v: w) das Gewebegewicht. Vortex die Röhrchen bei RT für 72 h bei maximaler Geschwindigkeit (dh </em> 3.200 Umdrehungen pro Minute); heftiges Vortexen erleichtert die mechanische Störung der ECM. Übertragen Sie die Extrakte in neue Röhrchen. Zentrifuge bei 16.000 × g für 10 min bei 4 ° C und bei -20 ° C bis zur Verwendung. 2. Proteinquantifizierung und Niederschläge HINWEIS: Aufgrund der Gegenwart von Detergentien, der SDS-Puffer ist inkompatibel mit direkter Proteinquantifizierung auf Basis von Messungen der Absorption bei 280 nm. Um sicherzustellen , reproduzierbare Quantifizierung verwenden kolorimetrische Assays für alle Proteinextrakten 17. Quantifizierung. Bereiten Standards für eine Kalibrierungskurve unter Verwendung von Rinderserumalbumin (BSA) in Reihe in dem entsprechenden Extraktionspuffer verdünnt (dh NaCl, SDS oder GuHCl) 17. Während dieser Zeit tauen die Probenextrakte. Man verdünnt die Proben in Extraktionspuffer zu erhalten Konzentrationen innerhalbDer lineare Bereich der Absorption; eine 1:10 Verdünnung (v: v) ergibt zufriedenstellende Ergebnisse. Verdünne die GuHCl – Proben mit einer gleichen Menge von ddH 2 O für die Quantifizierung, da der colorimetrische Assay nicht kompatibel mit Konzentrationen von> 4 M GuHCl ist. Verwenden einen Bicinchoninsäure (BCA) -basierte kolorimetrischen Test 17 (siehe die Tabelle des Materials), nach den Anweisungen des Herstellers für Assays in 96-Well – Platten; es wird empfohlen, mindestens zwei Messungen durchzuführen. Nach Inkubation für 30 min, nehmen Absorptionsablesungen bei einer Wellenlänge von 570 nm , um 17 , um die Proteinkonzentration unter Verwendung der BSA – Standardkalibrierungskurve zu berechnen. Protein Precipitation Thaw GuHCl extrahiert bei RT. Aliquot 10 ug Protein für jede Probe in neue Röhrchen. Für eine direkte Glycopeptid Analyse aliquote 50 ug. In dem 10-fache Volumen Ethanol und incuBeize über Nacht bei -20 ° C. HINWEIS: GuHCl ist nicht kompatibel mit weiteren enzymatischen Reaktionen und die meisten elektrophoretische Anwendungen. Die Entfernung von GuHCl wird vor Deglykosylierung und Trypsinverdaus erforderlich. Die Löslichkeit von GuHCl in Ethanol und umgekehrt, ermöglicht die geringe Löslichkeit von Proteinen für die effektive Entfernung von GuHCl während 18 ungefähr eine 98% ige Rückgewinnung von Proteinen ergeben. Zentrifugiere die Proben bei 16.000 × g für 30 min bei 4 ° C und saugt den Überstand. Achten Sie darauf, nicht das gefällte Pellet zu stören. Trocknen Sie die Pellets für 15 min ein Vakuum – Konzentrator (siehe die Tabelle der Materialien) bei RT. HINWEIS: Das Protokoll gestoppt hier werden kann, und die getrockneten Pellets bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert. Gegebenenfalls kann eine Gelelektrophorese als Qualitätskontrolle laufen gelassen (QC, den Supplemental Methods sehen). 3. Sequenzielle Deglycosylation für dieBewertung der N-Glykosylierungsstelle Belegung Während der Probentrocknung (siehe Schritt 2.2.2), bereitet die Deglykosylierung Puffer, die Deglykosylierung Entzweigungsenzym, gemäß Tabelle 1. Siehe Tabelle der Materialien für Produktdetails. Fügen Sie 10 & mgr; l Puffer Deglykosylierung Enzyme zu jeder Probe enthält. Stellen Sie sicher, die entsprechenden Pellet Aufwirbelung durch einen schnellen Wirbel und Spin-down von Proben durchzuführen. HINWEIS: Die Entfernung von Zucker Monomeren Entzweigungsenzyme verwendet, ist wesentlich für die Folge- und die vollständige Entfernung von O-verknüpften komplexen Sacchariden und erleichtert die spätere Spaltung von N-verknüpften Zuckern durch PNGase-F. bei 25 ° C für 2 h Inkubieren für die Entfernung von Heparansulfat von Heparinase II.Increase die Temperatur auf 37 ° C und Inkubation für 36 h unter leichtem Rühren zu ermöglichen. HINWEIS: die niedrigen Reaktionsvolumina und verlängerte Inkubationszeiten gegeben, Verwendung Inkubationsschüttlern und dicht packt mehr 1,5 ml Wannees in einem 50 ml-konischen Rohr im Inkubator bei etwa 45 ° gelehnt. Nach 36 h Zentrifugation der Proben für 1 min bei 16000 xg und verdampfen die H 2 O aus den Proben durch ein Vakuum – Konzentrator bei RT unter Verwendung von etwa 45 min. Resuspendieren der getrockneten Proben mit 10 & mgr; l H 2 18 O , das 50 U / ml PNGase-F, die spaltet alle Asparagin-gebundenen Glycane in einer Desamidierung Reaktion. HINWEIS: Die sich ergebende Asparaginsäure trägt eine überschüssige Masse von 2,98 Da, indikativ für die Anwesenheit von N-Glykosylierung während MS-Analyse. Inkubieren für 36 h bei 37 ° C unter ständigem Rühren in dem Inkubator-Schüttler. 4. In-Lösung Trypsinverdaus HINWEIS: Dieser Schritt sollte für beide nicht-deglycosyliert (dh verwendet für die direkte Glycopeptid – Analyse) und entglykosylierte Proben durchgeführt werden (dh für die Beurteilung von Glycan oc verwendetcupancy). Verwenden 10 ug des Gesamtproteins für die Beurteilung der N-Glycosylierungsstelle occupancy (wie im vorherigen Schritt angegeben). Für die Proben für die direkte Glycopeptid Analysen, verwenden 50 ug Protein als Ausgangsmenge. HINWEIS: Die folgenden Schritte werden für 10 ug Protein beschrieben. Scale up th evolumes (dh 5 – mal für 50 & mgr; g) nach Bedarf. Denaturieren der Proteine an jeder Probe Aliquot unter Verwendung von 9 M Harnstoff und 3 M Thioharnstoff, mit Endkonzentrationen von 6 M Harnstoff und 2 M Thioharnstoff, bzw. (zB für eine 10 ul Probe, 20 ul Harnstoff / Thioharnstoff). Reduziert die Proteine ​​durch Zugabe von 100 mM Dithiotreitol (DTT, 3,33 ul, Endkonzentration: 10 mM). bei 37 ° C inkubieren für 1 h unter Rühren bei 240 Umdrehungen pro Minute. Abkühlung der Proben auf RT bevor die Alkylierung durchführt durch Zugabe von 0,5 M Iodacetamid (3,7 ul, Endkonzentration: 50 mM). Inkubieren im Dunkeln für 1 h. Verwenden vorgekühlten (-20° C) Aceton (6-mal das Volumen der Probe), die Proben über Nacht bei -20 ° C inkubieren. Präzipitats durch Zentrifugieren bei 14.000 xg für 25 min bei 4 ° C. Den Überstand aspirieren. Achten Sie darauf, nicht das gefällte Pellet zu stören. Trocknen Sie die Protein-Pellets mit einem Vakuum-Konzentrator für 30 min bei RT. Resuspendieren in 20 & mgr; l von 0,1 M Triethylammoniumbicarbonat (TEAB) Puffer, pH 8,2, enthaltend Trypsin (0,01 ug / ul), und über Nacht bei 37 ° C und 240 rpm verdauen. Stoppen der Digestion durch die Proben mit 10% Trifluoressigsäure angesäuert (TFA, 2 & mgr; L für eine Endkonzentration von 1% TFA). 5. Peptid Cleanup Mit C18-Säulen HINWEIS: Die Entfernung von Verunreinigungen aus dem Peptidgemisch nach Verdau reduziert Ionensuppression und verbessert Signal-zu-Rausch-Verhältnisse und Sequenzabdeckung stören. Dieser Schritt soll sowohl für nicht-entglykosylierte und entglykosylierte sa durchgeführt werdenmples. Aktivieren das Harz auf der C18 Schleuderplatte (siehe die Tabelle von Materialien) unter Verwendung von 200 ul Methanol pro Vertiefung und Zentrifuge bei 1000 × g für 1 min. Waschen durch Zugabe von 200 & mgr; l pro Vertiefung von 80% Acetonitril (ACN) und 0,1% TFA in H 2 O. Zentrifuge bei 1000 × g für 1 min. Äquilibrieren durch Zugabe von 200 & mgr; l pro Vertiefung von 1% ACN und 0,1% TFA in H 2 O. Zentrifuge bei 1000 × g für 1 min. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal. Laden der Proben (das gesamte Volumen) von Schritt 4 in die Vertiefungen des Harzes und Zentrifuge bei 1.500 × g für 1 min enthält. Neuladen des Durchfluss ein zweites Mal und die Zentrifugation wiederholt. Waschen durch Zugabe von 200 & mgr; l pro Vertiefung von 1% ACN und 0,1% TFA in H 2 O. Zentrifuge bei 1500 × g für 1 min. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal. Eluieren der Proben mit 170 & mgr; l pro Vertiefung von 50% ACN, 0,1% TFA in H 2 O. Zentrifuge bei 1500 × g für 1 min. Wiederholen Sie den vorherigen Schrittund kombinieren, um das gesammelte Eluat. Trocknen des Eluats unter Verwendung eines Vakuum-Konzentrator für 2 h bei RT. Wenn sie nicht sofort verwendet wird, hält die getrockneten Proben bei -80 ° C bis zur Verwendung. HINWEIS: deglycosylierten Proben für die Proteinidentifikation bestimmt ist nur bereit, nach diesem Schritt für die LC-MS / MS verwenden. Die Schritte 6 und 7 sind nicht für diese Proben erforderlich. Auftauen und die deglycosylierten Proben in 2% ACN und 0,05% TFA in H 2 O zu einer Protein – Endkonzentration von 0,5 ug / ul resuspendiert. Fahren Sie mit Schritt 6 für die direkte Glycopeptid Analyse von nicht-entglykosylierte Proben. Optional filtern, um die Peptide vor der Markierung mit Tandem-Massen-Tags (TMT); siehe die Supplemental Methoden für die Peptid der Filtration. 6. Kennzeichnung mit TMT (für Direkt Glycopeptidthioestern Analysis Only) Auftau und Resuspendieren der getrockneten Pellets in 50 ul 50 mM TEAB eine Konzentration von 1 ug / ul zu erhalten. Resusped die 0,8 mg-Fläschchen mit TMT Null (TMT 0, siehe Tabelle of Materials) Reagenz in 41 & mgr; l ACN. Folgen Sie den recommendantions des Herstellers für die Aufwirbelung. Beschriften der Peptidproben in einem Verhältnis von 50 ug Peptide bis 0,4 mg TMT 0 ( das heißt, 50 & mgr; l von Peptiden auf 20,5 & mgr; l TMT 0). 1 h bei RT inkubiert. Quenche die Markierungsreaktion durch Zugabe von 5% Hydroxylamin in einem Verhältnis 6: 100 (dh, 4,23 & mgr; l von 5% Hydroxylamin). 15 min bei RT inkubiert. Trocknen Sie die TMT 0 -markierten Peptid – Proben für 1 h bei RT unter Verwendung eines Vakuum – Konzentrator. Resuspendieren in 10 & mgr; l ddH 2 O. HINWEIS: Aufgrund der Glycan-Reste, Glycopeptide zeigen eine höhere Molekularmasse als nicht-glykosylierten Peptide. TMT 0 erhöht den Ladezustand von Glycopeptiden. Dies reduziert ihre relative Masse (m / z)-Ladungs-Verhältnissen und erleichtert die ETD-Fragmentierung. 7. Glycopeptid-Anreicherung Verwenden Reaktionspuffer im Kit enthalten (siehe die Tabelle der Materialien). Je 50 & mgr; l Bindungspuffer zu jeder 10 ul-Probe aus Schritt 6.5. Vortexen die glycocapture Harzlösung, bis es homogen wird. Verwenden eine zwitterionische hydrophile Wechselwirkung Flüssigchromatographie (ZIC-HILIC) -basierten 15 erfassen. 50 ul Aliquot der Harzsuspension in neuen 1,5 ml-Röhrchen. Spin für 1 min bei 2.500 xg und entfernen Sie den Überstand. Fügen Sie 60 & mgr; l der Probe (dh die Probe mit Bindungspuffer) zu den Rohren die Harzpellets enthält. Mischte mit einer Pipette und Inkubation bei RT für 20 min in Rühren bei 1.200 Umdrehungen pro Minute. Zentrifuge für 2 min bei 2000 × g und den Überstand in neue Röhrchen. Halten Sie die Rohre. Zugabe von 150 & mgr; l Waschpuffer zu den Harzrohren. Mischte mit einer Pipette und Inkubation bei RT für 10 min in Rühren bei 1.200 Umdrehungen pro Minute. Spin 2 min bei 2.500 x g. Übertragungder Überstand wird auf die gleichen Rohre (aus Stufe 7.4). Wiederholen Sie die Wäsche zweimal Schritte. In 75 & mgr; l Elutionspuffer und mischen mit einer Pipette. Agitieren bei 1200 rpm für 5 min bei RT und dann die Röhrchen für 2 min bei 2.500 x g zentrifugieren. Die Überstände auf neue 1,5-ml-Röhrchen. Wiederholen der Waschschritte und übertragen dann das Eluat Überstand in derselben Röhre. Zentrifugieren der Röhrchen , die das Eluat (dh Glycopeptide) für 2 min bei 2.500 x g. Den Überstand in neue Röhrchen um die Entfernung von jeglichem verbleibenden Harzes aus den vorherigen Schritten zu gewährleisten. Trocknen Sie die insgesamt 150 & mgr; l des Eluats unter Verwendung eines Vakuum-Konzentrator für ca. 2 h bei RT. Resuspendieren der getrockneten Nieder Glycopeptide in 15 ul 2% ACN und 0,05% TFA in ddH 2 O. Gehen Sie LC-MS / MS mit HCD-Fragmentierung auszuführen, um die ECM-Protein-Zusammensetzung zu analysieren und LC-MS / MS mit HCD und ETD-Fragmentierung für Glycopeptid Charakterisierung. Siehe Abschnitt 8. </ol> 8. massenspektrometrischen Analyse Führen Sie LC-MS / MS-HCD-Fragmentierung mit der ECM-Protein-Zusammensetzung zu analysieren; siehe die Supplemental Methoden für weitere Einzelheiten. Führen Sie LC-MS / MS mit HCD und ETD – Fragmentierung für Glycopeptid Charakterisierung (siehe Zusatz Methoden für Details); die angereicherte Probe sollte 15 zu dem nicht-angereicherten Vormaterial verglichen werden. HINWEIS: Detaillierte Beschreibungen des LC-MS / MS-Verfahrens für indirekte Glycopeptid Analyse, direkte Glycopeptid-Analyse und Datenbanksuche ist in den Supplemental Methoden zur Verfügung gestellt. Die Forscher interessiert sich für die Charakterisierung ECM – Protein und Glykan Zusammensetzung unter Verwendung von Massenspektrometrie sind 3, 11, 15 zu früheren Veröffentlichungen verweisen ermutigt.

Representative Results

Ein schematischer Arbeitsablauf des Protokolls ist in Figur 1 vorgesehen. ECM Extraktionsprotokoll Die Effizienz der Extraktion kann durch Ausführen von Aliquots zur Sichtbarmachung jedes Extrakt auf Bis-Tris Acrylamidgelen und unter Verwendung von Silberfärbung bilden überwacht werden. 2A zeigt die Komplementarität des NaCl, SDS und GuHCl extrahiert nach sequentieller Extraktion. Dies ermöglicht QC Identifizierung potentieller Probleme mit der Probenqualität wie übermäßiger Proteinabbau. Nach der Extraktion ist, ECM Glykoproteine reichlich in den GuHCl – Extrakten (2B). Deglycosylation Um die Effizienz der Deglycosylierung beurteilen zu können, eine nicht-entglykosylierte Kontrolle sollte in pa ausgeführt werdenrallel. Deglykosylierung Zeiten haben sich als geeignet , eine vollständige und homogene Entfernung von Zuckerresten zu erreichen, wie in 3A veranschaulicht. 3B zeigt ein repräsentatives Beispiel von Proben effizient durch die Zugabe von Enzymen zur Entfernung GAG und Deglykosylierung Enzymen deglycosyliert , die kleinen N- und O-verknüpften Oligosaccharide zielen. Glycoproteomics Das Protokoll zur Prüfung der Belegung von NxT / S Sequons verbessert Proteinsequenzabdeckung für ECM – Glykoproteine nach MS (3C) und ermöglicht eine anfänglichen Screenen der Anwesenheit von Glycoproteinen. Dies hilft, die Suchzeit für Glycopeptide zu reduzieren, wie Datenbanken angepasst werden können, um zuvor identifizierten Glykoproteine ​​zu enthalten. HCD-ETD-Fragmentierung ist für die Identifizierung und Charakterisierung der Zusammensetzung von Oligosacchariden zu angebracht ECM g verwendet lycoproteins. 4A zeigt ein repräsentatives Spektrum für eine mit 18 O nach Deglykosylierung (indirekte Glycopeptid – Analyse) markierte Peptid erhalten. 4B ist ein repräsentatives Beispiel für ein Spektrum nach der Analyse von intaktem Glycopeptide aus ECM – Extrakten (direkte Glycopeptid – Analyse) erhalten. Figur 1: Verfahren Übersicht. (A) nach sequentieller Anreicherung für ECM – Proteine, LC-MS / MS – Analysen werden auf den deglykosylierten Extrakten durchgeführt. (B) Alternativ können nicht deglycosylierten ECM – Extrakte werden weiter für Glykopeptide angereichert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 2" src = "/ files / ftp_upload / 55674 / 55674fig2.jpg" /> Abbildung 2: Die Extraktion von ECM – Proteinen. (A) Die 3 verschiedenen Extrakte aus dem sequentiellen Extraktionsverfahren ( „Englisch Quick Step“) komplementär sind , in ihrer Eiweißgehalt. Während SDS-Extrakte in intrazellulärer Proteine ​​angereichert sind, enthalten GuHCl-Extrakten, die Mehrheit der ECM-Proteinen. Erfolgreiche Fraktionierung wird durch die verschiedenen Silberfärbung Muster sichtbar gemacht. (B) ECM – Proteine wie beispielsweise die kleine leucinreichen Proteoglykane Decorin, Biglycan und mimecan werden überwiegend in den GuHCl – Extrakten nachgewiesen, mit wenig Präsenz in dem SDS und NaCl extrahiert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 3. Analyse von Glycosylation. (A) Geeignete Inkubationszeiten sind für die vollständige Deglycosylierung erforderlich. Das Beispiel zeigt die Auswirkung der Inkubationszeit während der Entfernung von Glycosaminoglycanketten vom Glykoprotein Decorin. (B) ECM – Glykoproteine sind mit großen und repetitiven Glycosaminoglycanketten und kurzen und diversen N- und O-gebundenen Oligosacchariden. Spur 1 auf jedem des Immunoblots darstellt unbehandelten Herzextrakt. Spur 2 enthält Extrakte mit Enzymen behandelt, die Glykosaminoglykane verdauen. Proben in Spur 3 enthalten zusätzlich, Enzyme zur Entfernung von N- und O-verknüpften oligossacharides. Galectin-1 ist nicht glykosyliert, daher gibt es keine Verschiebung in Proteingröße. Angepasst von Lynch M, et al. 4 (C) in der LC-MS / MS – Analyse, behandelten Proben mit PNGase-F in Gegenwart von H 2 18 OS bessere Sequenzabdeckung (%, auf der rechten Seite) im Vergleich zu nicht-deglycosylierten Proben erreichen. DLade Grünflächen repräsentieren Sequenzabdeckung durch LC-MS / MS. Die roten, gepunkteten Linien repräsentieren glycosites, mit Zahlen ihrer Aminosäureposition angibt. Der Nachweis der Glykosylierung von Decorin an Position Asn 211 (N, fett markiert) wird im Detail als Beispiel in Abbildung 4 dargestellt Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 4. Glycopeptidthioestern Analyse von MS. (A) Unter Verwendung einer Shotgun – Ansatz auf die Proteomik ECM angereicherten Extrakte können Glycopeptide durch die Anwesenheit von deamidierten Asparagin innerhalb NxT / S Sequons und markiert mit 18 O. identifiziert werden , Das Beispiel zeigt eine HCD MS / MS – Spektrum für ein Peptid von Decorin die enthält Asn 211 glykosyliert zuvor. Die erhaltenen Daten können verwendet werden,eine maßgeschneiderte Datenbank von ECM-Glykoproteine ​​zu erstellen. (B) HCD-ETD – Fragmentierung wird verwendet , um das Glycopeptid angereicherten Extrakt ECM zu analysieren. Das ETD-MS / MS-Spektrum ermöglicht die Charakterisierung von Glycan-Zusammensetzung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. A. Stammlösungen DTT (Dithiotreitol, C 4 H 10 O 2 S 2) 100 mM DTT in ddH 2 O. 1 EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure, C 10 H 16 N 2 O 8) 250 mM EDTA in ddH 2 O, pH 8,0. GuHCl (Guanidin – Hydrochlorid, CH 6 ClN 3) 8 M GuHCl inddH 2 O. IAA (Iodacetamid, C 2 H 4 INO) 500 mM IAA in ddH 2 O 1,2 Na – Acetat (Natriumacetat, C 2 H 3 NaO 2) 1 M Na – Acetat in ddH 2 O, pH 5,8. NaCl (Natriumchlorid, NaCl) 1 M NaCl in ddH 2 O. Na zweibasiges Phosphat (Dinatriumphosphat, Na 2 H 2 PO 4) 1 M Na zweibasige Phosphat in dd H 2 O, pH 6,8. SDS (Natriumdodecylsulfat, NaC 12 H 25 SO 4) 1% SDS (35 mM) in ddH 2 O 3 TFA (Trifluoressigsäure, C 2 HF 3 O 2) 10% TFA (1,2 M) in ddH 2 O. TEAB (Triethylammoniumbicarbonat, C 7 H 17 </sub> NO 3) 1 M TEAB in in ddH 2 O, pH 8,5 Thioharnstoff (Thioharnstoff, CH 4 N 2 S) 3 M Thioharnstoff in ddH 2 O. Tris-HCl (Tris-Hydrochlorid (NH 4 11 C O 3 [HCl]) 100 mM Tris-HCl in ddH 2 O, pH 7,5. Urea (Harnstoff, CH 4 N 2 O) 9 M Harnstoff in ddH 2 O. B. Reaktionspuffer C18 Bereinigungs Äquilibrierungspuffer 1% ACN, 0,1% TFA in ddH 2 O C18 Clean-up-Säule Waschpuffer 80% ACN, 0,1% TFA in H 2 O C18 clean-up Elutionspuffer 50% Acetonitril, 0,1% TFA in ddH 2 O Deglycosylation Buffer (4x) 600 mM NaCl und 200 mM Na – Phosphat in ddH 2 O, pH 6,8. GuHCl – Puffer 4 4 M Guanidinhydrochlorid, 50 mM Na – Acetat und 25 mM EDTA in ddH 2 O, pH 5,8. 1: 100 (v: v) von Cocktail von Proteinase-Inhibitoren vor dem Gebrauch. NaCl – Puffer 4 0,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl und 25 mM EDTA in ddH 2 O, pH 7,5. 1: 100 (v: v) von Cocktail von Proteinase-Inhibitoren vor dem Gebrauch. PBS (1x) 1,7 mM KH 2 PO 4, 5 mM Na 2 HPO 4, 150 mM NaCl, pH 7,4. Zugabe von 25 mM EDTA und 1: 100 (v: v) von Cocktail von Protease-Inhibitoren vor dem Gebrauch. Probenpuffer (4x) 100 mM Tris, 2% SDS, 40% Glycerol, 0,02% Bromphenolblau in ddH 2 O, pH 6,8. In 10% ß-Mercaptoethanol vor dem Gebrauch. SDS – Puffer 4 0,1% SDS und 25 mM EDTA in ddH 2 O 1: 100 (v: v) von Cocktail von Proteinaseinhibitoren befErz Einsatz. C. Enzyme Chondroitinase ABC 5 0,5 U / ml in Deglykosylierung Puffer (1x) Keratanase 5 0,1 U / ml in Deglykosylierung Puffer (1x) Heparinase II 5 0,1 U / ml in Deglykosylierung Puffer (1x) α2-3,6,8,9-Neuraminidase (Sialidase) 5 0.025 U / ml in Deglykosylierung Puffer (1x) β1,4-Galactosidase 5 0,015 U / mL in Deglykosylierung Puffer (1x) ß-N-Acetylglucosaminidase 5 0,25 U / ml in Deglykosylierung Puffer (1x) Endo-α-N-Acetylgalactosaminidase (O-Glycosidase) 5 0,013 U / mL in Deglykosylierung Puffer (1x) PNGase-F (N-Glycosidase-F) 6 50 U / ml in H 2 18 O Trypsin 0,01 ug / ul in TEAB-Puffer Anmerkungen zur Tabelle. 1 Halt Stammlösung bei -20 ° C eingefroren. 2 IAA sollte gehalten vor Licht geschützt werden. 3 SDS kristallisiert leicht bei <20 ° C. Um die Solubilisierung von 1% SDS (Stammlösung) zu erleichtern, erwärmen die Puffer unter heißem Leitungswasser. 4 Extraktionspuffer können bei RT gelagert werden. In Breitspektrum-Cocktail von Proteinase-Inhibitoren wie vor der Verwendung angegeben. 5 Diese Enzyme sollten während des ersten Deglykosylierung Schritt hinzugefügt werden. 6 PNGase-F nur sollte während der zweiten Stufe zugegeben Deglykosylierung. </td> Tabelle 1: Stammlösungen, Reaktionspuffer und Enzyme. In dieser Tabelle sind die Zusammensetzung jeder Stammlösung und Reaktionspuffer für die Extraktion und die anschließende Verarbeitung erforderlich (einschließlich enzymatischen Verdaus) der kardialen ECM-Proteine ​​vor der MS-Analyse.

Discussion

Dieses Proteomik-Protokoll hat sich in den letzten Jahren in unserem Labor optimiert. Hier verwendeten wir das Herzgewebe, sondern nur kleinere Anpassungen können für ihre Anwendung auf andere Gewebe erforderlich. Zum Beispiel muss das Extraktionsprotokoll die Zellularität des Gewebes berücksichtigen. Herzgewebe ist hoch im Vergleich zu zellulären Gefäßgewebe. Wenn Gefäßgewebe verwendet, kann die SDS – Konzentration geringer (dh 0,08%) sein , und die Dezellularisierung Zeit kürzer ist (dh 4 h) ^{11, 12, 13.} Die Verwendung von Enzymen Deglykosylierung ist entscheidend für die LC-MS / MS-Analyse von ECM-Zusammensetzung. Allerdings müssen Inkubationszeiten für verschiedene Gewebetypen angepasst werden. Zum Beispiel Heparinase II verlängert erforderliche Inkubationszeiten bei 25 ° C , wenn die Proben wie Haut verwendet, die in Basalmembranproteine reich sind (zB Agrin, Perlecan) (Daten nicht gezeigt). Direkte Glycopeptid – Analyse kann auf konditionierten Medien von Zellen in Kultur ¹⁵ durchgeführt werden. Anreicherungsschritte können nicht für die Analyse dieses vereinfachten Subproteom erforderlich. Ähnlich wie GuHCl Extrakte, NaCl-Extrakte sind auch zugänglich für glycoproteomics Analyse mit geringfügigen Modifikationen. Andere Extraktionsprotokolle zur Anreicherung von ECM – Proteine können ECM Glycopeptide ¹⁹ zu charakterisieren angepasst ^{werden, 20.}

Glykosylierung ist die komplexeste PTM ^5. Indirekte Identifizierung der Glycopeptide wird durch den Nachweis von deamidierten Asn mit eingearbeiteten ¹⁸ O bei einer NxT / S sequon erreicht. Deamidiertes Asn an anderen Positionen kann zu Fehlalarmen darstellen. Ebenso N-Glykosylierung ist im Kontext von Protein Ontologien in Betracht gezogen werden: intrazellulärer Proteine ​​eine NxT / S sequon enthalten, werden nicht glykosyliert sein, sondern könnten zu falsch positiven Ergebnissen geben. Als aktuelle search Algorithmen erlaubt nicht für das Screening von PTMs in vorbestimmten Sequenzen nur (dh bei Asn NxT / S), manuelle Filterung der Daten erforderlich ist . Identifizierung der Anwesenheit / Abwesenheit von Glykosylierung an diesen Stellen kann zwischen Krankheit und Kontrollproben verglichen werden. Es gibt kein Enzym äquivalent PNGase F für O-Deglykosylierung (dh eine Massenverschiebung auf Threonin oder Serin einzuführen). Daher wird die Identifizierung der O-Glykosylierung zu direkter Glycopeptid Analyse beschränkt. Direkte Glycopeptid Analyse wird verwendet, Informationen über die Zusammensetzung von Zuckern an Proteine ​​gebunden zu erhalten, aber keine strukturellen Informationen der Glycan. Darüber hinaus ist die Glycan-Zusammensetzung das Ergebnis der Glycan-Synthese und Verarbeitung nach der Sekretion.

3 Schritte Extraktionsverfahren für die ECM – Proteine ( „Englisch Quick Step“) ⁶ haben erlaubt , die ECM in einer Vielzahl von kardiovaskulären Geweben zu charakterisieren. Die Fraktionierung des Gewebesin mehrere Auszüge erforderlich , um ein vereinfachtes ECM Proteom zu erhalten , wie an anderer Stelle ⁶ diskutiert. Intrazellulärer Proteine ​​würden sonst zu einem übermäßigen Dynamikbereich von Protein Abundanzen in den Extrakten beitragen, die Identifizierung von weniger reichlich ECM-Proteinen verhindern würde. Darüber hinaus tragen die intrazelluläre Proteine O-Glykosylierungen ⁵ , die ECM – Glycopeptid Anreicherung und anschließende MS – Analyse komplizieren würde. Andere Autoren angewendet ähnliche Extraktionsmethoden zum Beispiel Lunge ²¹ und Knorpelgewebe zu charakterisieren ^10, jedoch haben sie die Analyse der Glykosylierung nicht verfolgen. Frühere Analysen der Glykosylierung auf der Identifizierung von glycosites konzentrierten sich nur, erfordern den Ausbau des Glycans aus dem Proteinkern und können nicht O-Glykosylierung ^{22, 23} beurteilen. Lektin-Arrays und chemische Anreicherung ist für die Beurteilung der Glycan Ausführung lieferbares an biologischen Proben auf der Grundlage ihrer Bindungsspezifität, aber diese Techniken Glycan Typen an spezifische Proteine ²⁴ nicht zuordnen können , noch können sie Glykosylierungsstellen beurteilen.

Zunächst haben wir Gelelektrophorese vor dem LC-MS / MS von ECM-Proteinen. Obwohl Geltrennung in Erhalt vereinfachten Proteinfraktionen zugänglich LC-MS / MS-Analyse nützlich ist, bieten die neuesten Instrumente schnelleren Abtastgeschwindigkeiten. Somit kann der elektrophoretischen Trennschritt weggelassen werden. Dies bietet einen zusätzlichen Vorteil, als große ECM-Proteine, die oben auf dem Gel zurückgehalten werden, werden effizienter analysiert. Jedoch Informationen, um die Mw der intakten Proteine ​​in Bezug verloren. Der Verdampfungsschritt vor der PNGase F Deglykosylierung sorgt für die vollständige Entfernung von regulärem H ₂ O falsch Negativ zu minimieren. Zuckerresten (also variable Glykan Massen) stören die Trennung durch LC und des Kompromisses Identifizierung nachfolgende Peptid durch MS / MS. A pein-Deglykosylierung Protokoll wird auch für Proteomanalyse von ECM-Proteine ​​nicht empfohlen, auf Glykosylierung konzentriert.

Proteomics kann noch nie da gewesenen Einblick in das ECM bereitzustellen. Jenseits struktureller Unterstützung, an der ECM gebunden Glykane sind wesentlich für Wirt-Pathogen – Wechselwirkung, Zell-Zell – Kommunikation und die Immunantwort ^25, dh , Allotransplantatabstoßung nach Organtransplantation. Glycoproteomics wird ein unverzichtbares Werkzeug in glycobiology sein.

Materials

A. Chemicals
Acetonitrile, MS-grade (ACN, C2H3N)	Thermo Scientific	51101	5.2-5.8, 6.2, 7.11, Supp 2, 3, 4
Cocktail of proteinase inhibitors	Sigma-Aldrich	P8340	1.3,  1.4.1, 1.5.1, 1.6.1
Disodium phosphate (Na2H2PO4)	Sigma-Aldrich	S7907	3.1
Dithiotreitol (DTT, C4H10O2S2)	Sigma-Aldrich	D0632	4.3
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, C10H16N2O8)	Sigma-Aldrich	E9884	1.3,  1.4.1, 1.5.1, 1.6.1
Ethanol (C2H6O)	VWR	437433T	2.2.1
Guanidine hydrochloride (GuHCl, CH6ClN3)	Sigma-Aldrich	G3272	1.6.1
Glycerol (C3H8O3)	Acros organics	158920025	Suppl 1.1
H2O LC-MS Cromasolv	Sigma-Aldrich	39253-1L-R	Throughout the protocol
H218O	Taiyo Nippon Sanso	FO3-0027	3.5
Hydroxylamine (HA, H3NO)	Sigma-Aldrich	467804	6.4
Iodoacetamide (IAA, C2H4INO)	Sigma-Aldrich	A3221	4.4
Phosphate-buffered Saline (PBS), 10X	Lonza	51226	1.3
Sodium acetate (C2H3NaO2)	Sigma-Aldrich	S7545	1.6.1
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	1.4.1, 3.2
Sodium dodecyl sulfate (SDS, NaC12H25SO4)	Sigma-Aldrich	466143	1.5.1
Triethylammonium bicarbonate (TEAB, C7H17NO3)	Sigma-Aldrich	11268	4.7, 6.1
Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2)	Sigma-Aldrich	T62200	4.8, 5.2-5.8, 7.11, Supp 2, 3
Thiourea (CH4N2S)	Sigma-Aldrich	T8656	4.2
Tris-hydrochloride (Tris-HCl, NH11C4O3[HCl])	Sigma-Aldrich	T3253	1.4.1, Suppl 1.
Urea (CH4N2O)	Sigma-Aldrich	U1250	4.2
Name	Company	Catalog Number	Comments
B. Enzymes
α2-3,6,8,9-Neuraminidase (Sialidase)	EDM Millipore	362280 (KP0012)	3.1
β1,4-Galactosidase	EDM Millipore	362280 (KP0004)	3.1
β-N-Acetylglucosaminidase	EDM Millipore	362280 (KP0013)	3.1
Chondroitinase ABC	Sigma-Aldrich	C3667	3.1
Endo-α-N-acetylgalactosaminidase (O-glycosidase)	EDM Millipore	362280 (KP0011)	3.1
Heparinase II	Sigma-Aldrich	H6512	3.1
Keratanase	Sigma-Aldrich	G6920	3.1
PNGase-F (N-Glycosidase F)	EDM Millipore	362280 (KP0001)	3.5
Trypsin	Thermo Scientific	90057	4.7
Name	Company	Catalog Number	Comments
C. Reagent kits
30 kDa MWCO spin filters	Amicon, Millipore	10256744	5.9, Suppl 2
Macro SpinColumn C-18, 96-Well Plate	Harvard Apparatus	74-5657	5.1
NuPAGE Novex BisTris Acrylamide Gels	Thermo-Scientific	NP0322PK2	Suppl 1
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23227	2.1.3
ProteoExtract Glycopeptide Enrichment Kit	Merk Millipore	72103	7
Tandem mass tag 0 (TMT0)	Thermo Scientific	900067	6.2, 6.3
Name	Company	Catalog Number	Comments
D. Equipment and software
Acclaim PepMap100 C18 Trap, 5mm x 300µm, 5µm, 100Å	Thermo Scientific	160454	Suppl 3, 4
Acclaim PepMap100 C18, 50cm x 75µm, 3µm, 100Å	Thermo Scientific	164570	Suppl 3
Byonic Search Engine	Protein Metrics	Version 2.9.30	Suppl 5
Dionex UltiMate 3000 RSLCnano	Thermo Scientific	n/a	Suppl 3, 4
EASY-Spray Ion Source	Thermo Scientific	ES081	Suppl 4
EASY-Spray PepMap RSLC C18,  50cm x 75µm, 2μm, 100Å	Thermo Scientific	ES803	Suppl 4
Mascot Search Engine	Matrix Science	Version 2.3.01	Suppl 3
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFADBMBHQ	Suppl 4
Proteome Discoverer Software	Thermo Scientific	Version 2.1.1.21	Suppl 3, 5
Picoview Nanospray Source	New Objective	550	Suppl 3
Q Exactive HF Mass Spectrometer	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFALGMBFZ	Suppl 3
Savant SpeedVac Concentrator	Thermo Scientific	SPD131DDA	2.2.2, 3.4, 4.6, 5.7, 6.5, 7.11
Scaffold Software	Proteome Software	Version 4.3.2	Suppl 3