Dette papir beskriver en metode til fremstilling af kardiovaskulære vævsprøver til MS-analyse, der giver mulighed for (1) analyse af ECM proteinsammensætning, (2) identifikation af glycosyleringssteder, og (3) sammensætningen karakterisering af glycan former. Denne metode kan anvendes, med mindre modifikationer, til studiet af ECM i andre væv.
Fibrose er kendetegnende for mange cardiovaskulære sygdomme og er forbundet med den forværret sekretion og aflejring af den ekstracellulære matrix (ECM). Anvender proteomik, har vi tidligere identificeret mere end 150 ECM og ECM-associerede proteiner i cardiovaskulære væv. Især er mange ECM-proteiner glycosyleret. Denne post-translationel modifikation påvirker proteinfoldning, opløselighed, binding og nedbrydning. Vi har udviklet en sekventiel ekstraktion og berigelse fremgangsmåde til ECM-proteiner, der er forenelig med den efterfølgende væskekromatografi-tandem-massespektrometri (LC-MS / MS) analyse af intakte glycopeptider. Strategien er baseret på sekventielle inkubationer med NaCl, SDS for væv decellulering, og guanidinhydrochlorid til opløseliggørelse af ECM-proteiner. Nylige fremskridt i LC-MS / MS omfatter fragmenteringsmetoder, såsom kombinationer af højere energi kollision dissociation (HCD) og elektronoverførselsmiddel dissociation (ETD), der muliggørden direkte analyse af sammensætningen af glycopeptider af ECM-proteiner. I det foreliggende papir beskriver vi en fremgangsmåde til fremstilling af ECM fra vævsprøver. Fremgangsmåden ikke kun mulighed for proteinprofilering men også vurdering og karakterisering af glycosylering af MS-analyse.
Fibrose er kendetegnende for mange sygdomme. Fibroblaster prolifererer og differentierer imod stærkt syntetiske fænotyper, som er forbundet med den forværret sekretion og aflejring af ekstracellulær matrix (ECM) 1. Overdreven ECM deposition kan fortsætte, selv efter den initiale skade er aftaget, hvilket fører til funktionel svækkelse. Anvender proteomik, har vi tidligere identificeret mere end 150 ECM og ECM-associerede proteiner i hjertevæv 2, 3. De er ikke kun strukturelle proteiner, men også matricellular proteiner og proteaser, der bidrager til den fortsatte ombygning og dynamisk tilpasning af hjertet. Især er mange ECM-proteiner glycosylerede 4. Denne post-translationel modifikation (PTM) indebærer tilsætning af sukkerrester til visse aminosyrepositioner, og den påvirker proteinfoldning, opløselighed, binding og nedbrydning 5 </sop>.
Der er to primære glycosylerings typer, der forekommer i pattedyr. (1) N-glycosylering optræder ved carboxamido nitrogen asparaginrester (Asn) i konsensussekvensen Asn-Xaa-Thr / Ser, hvor Xaa er en vilkårlig aminosyre bortset fra prolin. (2) I O-glycosylering, sukkerrester tillægger serin- og threoninrester (Ser, Thr) eller, i meget mindre grad, hydroxyprolin og hydroxylysin. Mens O-glycosylering kan forekomme i en række forskellige proteingrupper, er N-glycosylering begrænset til secernerede proteiner eller ekstracellulære domæner af membranproteiner 5. Dette gør N-glycosylering et attraktivt mål, når man studerer ECM.
Proteomics sætter en ny standard til analyse af protein-ændringer i sygdom. Hidtil har de fleste proteomics undersøgelser været fokuseret på intracellulære proteiner 6. Dette skyldes primært følgende årsager. Første, rigelige intracellulære proteiner hæmmer identikation af knappe ECM komponenter. Dette er især afgørende i hjertevæv, hvori mitokondrielle og myofilament proteiner udgør en stor andel af proteinindholdet 7. Sekund, integrale ECM-proteiner er stærkt tværbundne og vanskelige at solubilisere. Endelig tilstedeværelsen af rigelige PTMS (dvs. glycosylering) ændrer den molekylære masse, ladning og elektroforetiske egenskaber af peptider, der påvirker både adskillelse og identifikation ved væskekromatografi-tandem-massespektrometri (LC-MS / MS). I de senere år har vi udviklet og forbedret en sekventiel ekstraktion og berigelse fremgangsmåde til ECM-proteiner, der er kompatibel med efterfølgende massespektrometri (MS) analyse. Strategien er baseret på sekventielle inkubationer.
Det første trin udføres med NaCl, en ionisk buffer, der letter ekstraktionen af ECM-associeret og løst bundet ECM-proteiner, såvel som nyligt syntetiserede ECM-proteiner. Det jegs vaskemiddel fri, ikke-denaturerende, ikke-nedbrydende af cellemembraner, og medgørlige til yderligere biokemiske analyser 8. Derpå decellulering opnås med natriumdodecylsulfat (SDS). På dette trin, en lav SDS-koncentration sikrer membrandestabilisering og frigivelsen af intracellulære proteiner samtidig forhindre afbrydelse af de mere opløselige ikke-integrerede ECM komponenter. Endelig er ECM-proteiner ekstraheret med en guanidinhydrochlorid buffer (GuHCI). GuHCI er effektivt til at ekstrahere stærkt tværbundne proteiner og proteoglycaner fra væv, såsom sener 9, brusk 10, fartøjer 11, 12, 13 og hjertet 2, 3. Vi anvendte denne biokemiske fraktionering, i kombination med LC-MS / MS, at udforske ECM remodellering i kardiovaskulær sygdom 2 <sup>, 3, 11, 12, 13, 14. Nylige fremskridt i MS omfatter hidtil ukendte fragmenteringsmetoder, såsom kombinationer af højere energi kollision dissociation (HCD) og elektronoverførsel dissociation (EBD), der muliggør den direkte analyse af intakte glycopeptider 3, 15.
Her beskriver vi en metode til fremstilling af ECM for MS-analyse, der giver mulighed for analyse af protein sammensætning, identifikation af glycosyleringssteder, og karakterisering af glycan former. Sammenlignet med tidligere analyser af ECM glycosylering 16, denne metode giver mulighed for direkte vurdering af sammensætningsmæssige ændringer i glycosylerings profiler i en stedspecifik måde ved anvendelse af MS. Vi har anvendt denne metode til hjerte-kar-væv. Men det kan alså anvendes, med mindre modifikationer, til studiet af ECM i andre vævsprøver og kan give hidtil usete indsigt i ECM biologi.
Denne proteomics protokol er blevet optimeret i løbet af de sidste par år i vores laboratorium. Her anvendte vi hjertevæv, men kan være påkrævet kun mindre justeringer for dens anvendelse til andre væv. For eksempel ekstraktionsprotokollen må udnytte de cellularitet af vævet i betragtning. Hjertevæv er stærkt cellulære forhold til karvæv. Når der anvendes vaskulært væv, kan SDS-koncentrationen være lavere (dvs. 0,08%) og decellulering er kortere (dvs. 4 timer) 11, 12, 13. Anvendelsen af deglycosylering enzymer er afgørende for LC-MS / MS-analyse af ECM sammensætning. Imidlertid behøver inkubationstider, kan tilpasses for forskellige vævstyper. For eksempel heparinase II nødvendige udvidede inkubationstider ved 25 ° C ved anvendelse af prøver, såsom hud, der er rige på basalmembranproteiner (f.eks agrin, perlecan) (data ikke vist). Direkte glycopeptid analyse kan udføres på konditionerede medier fra celler i kultur 15. kan ikke kræves Berigelse trin til analyse af denne forenklede subproteome. Svarende til GuHCI ekstrakter, NaCl ekstrakter er også modtagelig for glycoproteomics analyse med mindre modifikationer. Andre ekstraktionsprotokoller til berigelse af ECM-proteiner kan tilpasses til at karakterisere ECM glycopeptider 19, 20.
Glycosylering er den mest komplekse PTM 5. Indirekte identifikation af glycopeptider opnås ved påvisning af deamideret Asn med taget 18 O ved en NXT / S sequon. Deamideret Asn i andre positioner kan repræsentere falske positiver. Ligeledes må N-glycosylering overvejes i sammenhæng med protein- ontologier: intracellulære proteiner indeholdende en NXT / S sequon vil ikke blive glycosyleret, men kunne give anledning til falske positive. Som aktuel Search algoritmer giver ikke mulighed for screening af PTMS på forudbestemte sekvenser alene (dvs. Asn ved NXT / S), er manuel filtrering af dataene kræves. Identifikation af tilstedeværelse / fravær af glycosylering i disse positioner kan sammenlignes mellem sygdom og kontrolprøver. Der er intet enzym svarende til PNGase F for O-deglycosylering (fx indføre en masseskift på threonin eller serin). Derfor er identifikationen af O-glycosylering begrænset til direkte glycopeptid analyse. Direkte glycopeptid analyse anvendes til at opnå information om sammensætningen af sukkerarter knyttet til proteiner, men indeholder ikke strukturel information af glycan. Desuden glycan sammensætning er resultatet af glycansyntese og forarbejdning efter sekretion.
Vores 3-trins ekstraktion fremgangsmåde til ECM-proteiner ( "engelsk Quickstep") 6 har tilladt kendetegner ECM i en række cardiovaskulære væv. Fraktionering af væveti flere ekstrakter kræves for at opnå en forenklet ECM proteom som diskuteret andetsteds 6. Intracellulære proteiner ellers ville bidrage til en stor dynamik af protein forekomster inden for de ekstrakter, der ville hindre identifikation af mindre rigelige ECM-proteiner. Desuden intracellulære proteiner bærer O-glycosyleringer 5, der ville komplicere ECM glycopeptid berigelse og efterfølgende MS-analyse. Andre forfattere anvendte lignende ekstraktionsmidler metoder til at karakterisere f.eks lunge 21 og bruskvæv 10, men de ikke foretage analysen af glycosylering. Tidligere analyse af glycosylering fokuseret på identifikation af kun glycosites, kræver fjernelse af glycan fra proteinet kerne, og kan ikke vurdere O-glycosylering 22, 23. Lectin arrays og kemisk berigelse er tilgængelige for vurdering af glycan types af biologiske prøver baseret på deres bindingsspecificitet, men disse teknikker kan ikke tildele glycan typer til specifikke proteiner 24 de kan heller vurdere glycosyleringssteder.
Oprindeligt anvendte vi gelelektroforese før LC-MS / MS af ECM-proteiner. Selvom gelseparation er egnet til opnåelse forenklede proteinfraktioner modtagelige for LC-MS / MS-analyse, de nyeste instrumenter giver hurtigere skanningshastigheder. Således kan den elektroforetiske separation trin udelades. Dette tilvejebringer en yderligere fordel som store ECM-proteiner, som de bevarer toppen af gelen, analyseres mere effektivt. Imidlertid oplysninger om Mw af de intakte proteiner tabt. Fordampningstrinnet før PNGase F deglycosylering sikrer fuldstændig fjernelse af regelmæssig H2O for at minimere falsk negative. Sukkerrester (dvs. variable glycan masses) interfererer med separation ved LC og kompromittere efterfølgende peptid identifikation ved MS / MS. En pen-deglycosylering protokol anbefales også til proteomics analyse af ECM-proteiner ikke fokuseret på glycosylering.
Proteomics kan give hidtil usete indsigt i ECM. Beyond strukturel støtte, glycaner knyttet til ECM er afgørende for vært-patogen interaktion, celle-celle-kommunikation og immunresponset 25, dvs. afstødelse efter organtransplantation. Glycoproteomics vil være et vigtigt redskab i Glycobiology.
The authors have nothing to disclose.
JBB er en karriere Etablering Fellow i Kongens British Heart Foundation Centre. MM er en Senior Fellow af British Heart Foundation (FS / 13/2/29892). Undersøgelsen blev støttet af et fremragende initiativ (kompetencecentre for Excellent Technologies – COMET) af den østrigske Research Promotion Agency FFG: "Research Center of Excellence i vaskulær Aging – Tyrol, VASCage" (K-Projekt nummer 843.536) og NIHR Biomedical Research Centre baseret på Guys og St. Thomas' National Health service Foundation Trust og Kings College London i partnerskab med Kings College Hospital.
A. Chemicals | |||
Acetonitrile, MS-grade (ACN, C2H3N) | Thermo Scientific | 51101 | 5.2-5.8, 6.2, 7.11, Supp 2, 3, 4 |
Cocktail of proteinase inhibitors | Sigma-Aldrich | P8340 | 1.3, 1.4.1, 1.5.1, 1.6.1 |
Disodium phosphate (Na2H2PO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | 3.1 |
Dithiotreitol (DTT, C4H10O2S2) | Sigma-Aldrich | D0632 | 4.3 |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, C10H16N2O8) | Sigma-Aldrich | E9884 | 1.3, 1.4.1, 1.5.1, 1.6.1 |
Ethanol (C2H6O) | VWR | 437433T | 2.2.1 |
Guanidine hydrochloride (GuHCl, CH6ClN3) | Sigma-Aldrich | G3272 | 1.6.1 |
Glycerol (C3H8O3) | Acros organics | 158920025 | Suppl 1.1 |
H2O LC-MS Cromasolv | Sigma-Aldrich | 39253-1L-R | Throughout the protocol |
H218O | Taiyo Nippon Sanso | FO3-0027 | 3.5 |
Hydroxylamine (HA, H3NO) | Sigma-Aldrich | 467804 | 6.4 |
Iodoacetamide (IAA, C2H4INO) | Sigma-Aldrich | A3221 | 4.4 |
Phosphate-buffered Saline (PBS), 10X | Lonza | 51226 | 1.3 |
Sodium acetate (C2H3NaO2) | Sigma-Aldrich | S7545 | 1.6.1 |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | 1.4.1, 3.2 |
Sodium dodecyl sulfate (SDS, NaC12H25SO4) | Sigma-Aldrich | 466143 | 1.5.1 |
Triethylammonium bicarbonate (TEAB, C7H17NO3) | Sigma-Aldrich | 11268 | 4.7, 6.1 |
Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) | Sigma-Aldrich | T62200 | 4.8, 5.2-5.8, 7.11, Supp 2, 3 |
Thiourea (CH4N2S) | Sigma-Aldrich | T8656 | 4.2 |
Tris-hydrochloride (Tris-HCl, NH11C4O3[HCl]) | Sigma-Aldrich | T3253 | 1.4.1, Suppl 1. |
Urea (CH4N2O) | Sigma-Aldrich | U1250 | 4.2 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
B. Enzymes | |||
α2-3,6,8,9-Neuraminidase (Sialidase) | EDM Millipore | 362280 (KP0012) | 3.1 |
β1,4-Galactosidase | EDM Millipore | 362280 (KP0004) | 3.1 |
β-N-Acetylglucosaminidase | EDM Millipore | 362280 (KP0013) | 3.1 |
Chondroitinase ABC | Sigma-Aldrich | C3667 | 3.1 |
Endo-α-N-acetylgalactosaminidase (O-glycosidase) | EDM Millipore | 362280 (KP0011) | 3.1 |
Heparinase II | Sigma-Aldrich | H6512 | 3.1 |
Keratanase | Sigma-Aldrich | G6920 | 3.1 |
PNGase-F (N-Glycosidase F) | EDM Millipore | 362280 (KP0001) | 3.5 |
Trypsin | Thermo Scientific | 90057 | 4.7 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
C. Reagent kits | |||
30 kDa MWCO spin filters | Amicon, Millipore | 10256744 | 5.9, Suppl 2 |
Macro SpinColumn C-18, 96-Well Plate | Harvard Apparatus | 74-5657 | 5.1 |
NuPAGE Novex BisTris Acrylamide Gels | Thermo-Scientific | NP0322PK2 | Suppl 1 |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | 2.1.3 |
ProteoExtract Glycopeptide Enrichment Kit | Merk Millipore | 72103 | 7 |
Tandem mass tag 0 (TMT0) | Thermo Scientific | 900067 | 6.2, 6.3 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
D. Equipment and software | |||
Acclaim PepMap100 C18 Trap, 5mm x 300µm, 5µm, 100Å | Thermo Scientific | 160454 | Suppl 3, 4 |
Acclaim PepMap100 C18, 50cm x 75µm, 3µm, 100Å | Thermo Scientific | 164570 | Suppl 3 |
Byonic Search Engine | Protein Metrics | Version 2.9.30 | Suppl 5 |
Dionex UltiMate 3000 RSLCnano | Thermo Scientific | n/a | Suppl 3, 4 |
EASY-Spray Ion Source | Thermo Scientific | ES081 | Suppl 4 |
EASY-Spray PepMap RSLC C18, 50cm x 75µm, 2μm, 100Å | Thermo Scientific | ES803 | Suppl 4 |
Mascot Search Engine | Matrix Science | Version 2.3.01 | Suppl 3 |
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | Suppl 4 |
Proteome Discoverer Software | Thermo Scientific | Version 2.1.1.21 | Suppl 3, 5 |
Picoview Nanospray Source | New Objective | 550 | Suppl 3 |
Q Exactive HF Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | Suppl 3 |
Savant SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific | SPD131DDA | 2.2.2, 3.4, 4.6, 5.7, 6.5, 7.11 |
Scaffold Software | Proteome Software | Version 4.3.2 | Suppl 3 |