Analyse til måling af nukleocytoplasmisk transport i realtid inden for motor neuronlignende NSC-34 celler
Summary
Denne protokol beskriver en metode til sensitivt at måle den nukleocytoplasmatiske transportrate inden for motorneuronlignende NSC-34-celler ved at kvantificere den realtidsændring i nuklearimporten af et NLS-NES-GFP-protein.
Abstract
Nukleocytoplasmisk transport henviser til import og eksport af store molekyler fra cellekernen. For nylig har en række undersøgelser vist en forbindelse mellem amyotrofisk lateralsklerose (ALS) og forringelser i den nukleocytoplasmatiske vej. ALS er en neurodegenerativ sygdom, der påvirker motorneuronerne og resulterer i lammelse og i sidste ende i døden inden for 2-5 år i gennemsnit. De fleste tilfælde af ALS er sporadiske og mangler nogen tilsyneladende genetisk binding, men 10% arves på en dominerende måde. For nylig blev hexanukleotid-gentagelsesudvidelser (HRE'er) i den åbne chromosom 9-læseramme 72 (C9orf72) -gen identificeret som en genetisk årsag til ALS og frontotemporal demens (FTD). Vigtigt har forskellige grupper for nylig foreslået, at disse mutanter påvirker nukleocytoplasmatisk transport. Disse undersøgelser har for det meste vist det endelige resultat og manifestationer forårsaget af HRE'er på nukleocytoplasmatisk transport, men de viser ikke nuklear transportdysfunktion irealtid. Som et resultat kan kun alvorlig nukleocytoplasmisk transportmangel bestemmes, hovedsagelig på grund af høj overekspression eller eksogen proteinindsættelse.
Denne protokol beskriver en ny og meget følsom analyse for at evaluere og kvantificere nukleocytoplasmisk transportdysfunktion i realtid. Importraten for et NLS-NES-GFP-protein (shuttle-GFP) kan kvantificeres i realtid under anvendelse af fluorescerende mikroskopi. Dette udføres ved at bruge en eksportinhibitor, hvilket gør det muligt for shuttle GFP kun at komme ind i kernen. For at validere assayet blev C9orf72 HRE-translaterede dipeptid-gentagelser, poly (GR) og poly (PR), som tidligere er blevet vist for at forstyrre nukleocytoplasmatisk transport, anvendt. Ved anvendelse af det beskrevne assay blev der observeret et 50% fald i den nukleare importrate sammenlignet med kontrollen. Ved anvendelse af dette system kan små ændringer i nukleocytoplasmatisk transport undersøges, og evnen hos forskellige faktorer til at redde (selv delvis) en nukleocytoplasmisk trAnsøgningsfejl kan bestemmes.
Introduction
Kernekernekomplekset (NPC) styrer import og eksport af store molekyler ind i og ud af cellekernen. I modsætning til små molekyler, som kan komme ind i kernen uden regulering 1 , styres transporten af større molekyler stærkt af NPC. Disse store molekyler, såsom proteiner og RNA, associerer med transportfaktorer, herunder import og eksport, der skal importeres og eksporteres fra kernen 2 . For at blive importeret skal proteiner indeholde et lille peptidmotiv, der generelt kaldes et nukleært lokaliseringssignal (NLS), som er bundet af importins 2 . Disse sekvenser af aminosyrer virker som et mærke og er forskellige i sammensætning 3 , 4 . Proteiner kan eksporteres fra kernen til cytoplasma på grund af deres tilknytning til exportinS, som binder en signalsekvens, der generelt kaldes et nukleært eksportsignal (NES) 2 . Både importins og exportins er i stand til at transportere deres gods på grund af reguleringen af den lille Ras-relateret nukleær protein GTPase (Ran) 2 . Ran har vist sig at eksistere i forskellige konformationelle tilstande afhængigt af om den er bundet til GTP eller BNP. Når det er bundet til GTP, kan Ran binde til importins eller exportins. Ved binding til RanGTP frigiver importins deres fragt, mens exportinsætninger skal binde RanGTP for at danne et kompleks med deres eksportlast. Den dominerende nukleotidbindende tilstand af Ran afhænger af dens placering i kernen (RanGTP) eller cytoplasmaet (RanGDP).
For nylig har en række undersøgelser vist en forbindelse mellem svækkelser i den nukleocytoplasmatiske vej og både amyotrofisk lateralsklerose (ALS) og frontotemporal demens (FTD) 5 , 6 </sup> , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . ALS er en progressiv og dødelig neurodegenerativ sygdom, der påvirker både øvre og nedre motorneuroner (MNs) 13 og resulterer i lammelse og i sidste ende i døden inden for 2-5 år i gennemsnit. De fleste tilfælde af ALS klassificeres som sporadisk (SALS), der mangler nogen tilsyneladende genetisk binding, men 10% arves på en dominerende måde (familie ALS; FALS). For nylig blev hexanukleotid-gentagelsesudvidelser (HRE'er) i den åbne læseramme 72 (C9orf72) -genet for kromosom 9 identificeret 14 , 15 som en genetisk årsag til ALS og FTD. Disse mutanter tegner sig for 30-40% af FALS-sagerne 16 , og forskellige undersøgelser har gjort gældendeAt de forårsager toksicitet ved at påvirke nukleocytoplasmisk transport 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 .
Disse undersøgelser har for det meste vist de endelige resultater og manifestationer af HRE'er på nukleocytoplasmisk transport, men de viser ikke nukleocytoplasmisk forstyrrelse i realtid. Som følge heraf er kun alvorlig nukleocytoplasmisk transportmangel blevet evalueret 11 , 17 , 18 .
Denne protokol beskriver en ny og veRy-sensitiv analyse for at evaluere og kvantificere nukleocytoplasmisk transportdysfunktion i realtid. Importraten for et NLS-NES-GFP-protein (shuttle-GFP) kan kvantificeres i realtid under anvendelse af fluorescerende mikroskopi. Dette gøres ved anvendelse af en eksportinhibitor som beskrevet tidligere 18 , således at shuttle-GFP kun kan komme ind i kernen. Ved hjælp af florescensmikroskopi og en software, der er i stand til at kvantificere fluorescerende ændringer i realtid, er det muligt at kvantificere gradvise ændringer i fluorescensintensiteten af shuttle-GFP, der er placeret i kernen. Som følge heraf kan en Michaelis-Menten-lignende mætningskurve af fluorescens-til-tid-akse, der repræsenterer mængden af nukleær shuttle-GFP på et hvilket som helst tidspunkt, fremstilles. Ved at anvende den oprindelige lineære hastighed for kurverne er det muligt at generere en hældning, som repræsenterer indgangshastigheden i kernen før fluorescensmætning.
For at validere assayet oversættesD C9orf72 dipeptid gentagelser, poly (GR) og poly (PR), som tidligere er blevet rapporteret at forstyrre nukleocytoplasmatisk transport, blev anvendt 5 , 7 , 8 , 10 , 12 . Ved hjælp af dette assay blev der observeret et 50% fald i den nukleare importrate sammenlignet med kontrollen. Ved anvendelse af dette system kan små ændringer i nukleocytoplasmatisk transport undersøges. Endvidere kan evnen af forskellige faktorer til at redde en nukleocytoplasmisk transportfejl bestemmes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol demonstrerer et meget følsomt og kvantitativt nyt assay til evaluering af små ændringer i nukleocytoplasmatisk transport. Ved anvendelse af dette system er det muligt at observere og måle nukleocytoplasmatisk transport og dets dysfunktion i realtid, ikke kun store defekter, som resulterer i dramatiske ændringer i proteinfordeling. Denne analyse har ikke kun en følsom fordel, men det kræver også lidt forberedelse, er billigt og er et meget let og lavt engagement analysen.
<p class="jove_content…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker alle medlemmer af AI laboratoriet for deres nyttige kommentarer og forslag. Vi vil gerne takke professor Mark Hipp (Max Planck Institute for Biochemistry) for at give os shuttle-GFP-vektoren. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Israels videnskabsstiftelse (ISF # 124/14), Binational Science Foundation (BSF # 2013325), FP7 Marie Curie Career Integration Grant (CIG # 333794) og National Institute for Psychobiology in Israel NIPI # b133-14 / 15).
Materials
| Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34) | tebu-bio | CLU140-A |
| DMEM 4.5g/L L-glucose | Biological Industries | 01-055-1A |
| FBS European Grade | Biological Industries | 04-007-1A |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 |
| Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3111 |
| Cover glass 12mm dia. thick 0.13-0.17mm | Bar Naor LTD | |
| TurboFect Transfection Reagent | Thermo Scientific | R0531 |
| Axiovert 100 inverted microscope | Zeiss | |
| IMAGING WORKBENCH 2 | Axon Instruments | |
| Leptomycin B | Sigma | L2913 |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A |
| Homogenizer motor/control/chuck/90-degree clamp | Glas-Col | 099C K5424CE |
| MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002455 |
References
- Alberts, B. . Molecular biology of the cell. , (2002).
- Freitas, N., Cunha, C. Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins. Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).
- Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. E. A short amino acid sequence able to specify nuclear location. Cell. 39, 499-509 (1984).
- la Cour, T., et al. Analysis and prediction of leucine-rich nuclear export signals. Protein Eng Des Sel. 17, 527-536 (2004).
- Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Sci Rep. 6, 20877 (2016).
- Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 129-133 (2015).
- Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).
- Kwon, I., et al. Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells. Science. 345, 1139-1145 (2014).
- Rossi, S., et al. Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS. J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).
- Shi, K. Y., et al. Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
- Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 56-61 (2015).
- Zhang, Y. J., et al. C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins. Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).
- Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).
- DeJesus-Hernandez, M., et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron. 72, 245-256 (2011).
- Renton, A. E., et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron. 72, 257-268 (2011).
- Boeve, B. F., et al. Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72. Brain. 135, 765-783 (2012).
- Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).
- Woerner, A. C., et al. Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA. Science. 351, 173-176 (2016).
- Tao, Z., et al. Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity. Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).
- Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84, 1213-1225 (2014).
