Analys för att mäta nukleocytoplasmisk transport i realtid inom motor neuronliknande NSC-34-celler
Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att noggrant mäta den nukleocytoplasmatiska transporthastigheten inom motor neuronliknande NSC-34-celler genom att kvantifiera förändringen i realtid i nukleär import av ett NLS-NES-GFP-protein.
Abstract
Nukleocytoplasmisk transport avser import och export av stora molekyler från cellkärnan. Nyligen har ett antal studier visat en samband mellan amyotrofisk lateralskleros (ALS) och nedsatt nukleocytoplasmisk vägen. ALS är en neurodegenerativ sjukdom som påverkar motorneuronerna och resulterar i förlamning och slutligen i död, inom 2-5 år i genomsnitt. De flesta fall av ALS är sporadiska, saknar någon uppenbar genetisk koppling, men 10% ärvt på ett dominerande sätt. Nyligen identifierades hexanukleotidrepetitionsutvidgningar (HRE) i kromosom 9 öppen läsram 72 (C9orf72) gen som en genetisk orsak till ALS och frontotemporal demens (FTD). Det är viktigt att olika grupper nyligen föreslog att dessa mutanter påverkar nukleocytoplasmisk transport. Dessa studier har mestadels visat det slutliga resultatet och manifestationer som orsakats av HRE på nukleocytoplasmisk transport, men de visar inte dysfunktion i kärntransporter irealtid. Som ett resultat kan endast allvarlig nukleocytoplasmisk transportbrist bestämmas, främst beroende på hög överuttryck eller exogen proteininsättning.
Detta protokoll beskriver en ny och mycket känslig analys för att utvärdera och kvantifiera nukleocytoplasmisk transportdysfunktion i realtid. Importen av ett NLS-NES-GFP-protein (shuttle-GFP) kan kvantifieras i realtid med användning av fluorescerande mikroskopi. Detta utförs genom att använda en exportinhibitor, vilket möjliggör att shuttle GFP bara kommer in i kärnan. För att validera analysen användes de C9orf72 HRE-translaterade dipeptidreceptionerna, poly (GR) och poly (PR), vilka tidigare har visats störa nukleocytoplasmisk transport. Med hjälp av den beskrivna analysen observerades en 50% minskning av nukleär importhastighet jämfört med kontrollen. Genom att använda detta system kan minutförändringar i nukleocytoplasmisk transport undersökas och förmågan hos olika faktorer att rädda (även delvis) en nukleocytoplasmisk trAnsökningsfel kan bestämmas.
Introduction
Kärnporekomplexet (NPC) kontrollerar import och export av stora molekyler in i och ut ur cellkärnan. I motsats till små molekyler, som kan komma in i kärnan utan reglering 1 , styrs transporten av större molekyler starkt av NPC. Dessa stora molekyler, såsom proteiner och RNA, associerar med transportfaktorer, inklusive importin och exportin, som ska importeras och exporteras från kärnan 2 . För att kunna importeras måste proteiner innehålla ett litet peptidmotiv, i allmänhet kallat en nukleär lokaliseringssignal (NLS), som är bunden av importins 2 . Dessa sekvenser av aminosyror verkar som en etikett och är olika i komposition 3 , 4 . Proteiner kan exporteras från kärnan till cytoplasma på grund av deras association med exportinS, som binder en signalsekvens, generellt kallad en kärntransportsignal (NES) 2 . Både importins och exportins kan transportera sin last på grund av reglering av den lilla Rasrelaterade kärnprotein-GTPasen (Ran) 2 . Ran har visats existera i olika konformationella tillstånd beroende på om den är bunden till GTP eller BNP. När den är bunden till GTP, kan Ran binda till import eller export. Vid bindning till RanGTP släpper importins sin last, medan exportinslutningar måste binda RanGTP för att bilda ett komplex med sin exportlast. Det dominerande nukleotidbindande tillståndet av Ran beror på dess placering i kärnan (RanGTP) eller cytoplasman (RanGDP).
Nyligen har ett antal studier visat en samband mellan försämringar i nukleocytoplasmisk vägen och både amyotrofisk lateralskleros (ALS) och frontotemporal demens (FTD) 5 , 6 </sup> , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . ALS är en progressiv och dödlig neurodegenerativ sjukdom som påverkar både övre och nedre motorneuroner (MNs) 13 och resulterar i förlamning och slutligen i död, inom 2-5 år i genomsnitt. De flesta fall av ALS klassificeras som sporadiska (SALS), saknar någon uppenbar genetisk koppling, men 10% ärar på ett dominerande sätt (familjen ALS, FALS). Nyligen identifierades hexanukleotidrepetitionsexpansioner (HRE) i kromosom 9 öppen läsram 72 (C9orf72) gen 14,15 som en genetisk orsak till ALS och FTD. Dessa mutanter står för 30-40% av FALS-fallen 16 , och olika studier har ifrågasattAtt de orsakar toxicitet genom att påverka nukleocytoplasmisk transport 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 .
Dessa studier har mestadels visat de slutliga resultaten och manifestationerna av HRE på nukleocytoplasmisk transport, men de visar inte nukleocytoplasmisk störning i realtid. Som ett resultat har endast svår nukleocytoplasmisk transportbrist utvärderats 11 , 17 , 18 .
Detta protokoll beskriver en ny och veRy-känslig analys för att utvärdera och kvantifiera nukleocytoplasmisk transportdysfunktion i realtid. Importen av ett NLS-NES-GFP-protein (shuttle-GFP) kan kvantifieras i realtid med användning av fluorescerande mikroskopi. Detta görs med användning av en exportinhibitor, såsom beskrivits tidigare 18 , vilket medger att shuttle-GFP enbart kommer in i kärnan. Med hjälp av floriserande mikroskopi och en mjukvara som kan kvantifiera fluorescerande förändringar i realtid, är det möjligt att kvantifiera gradvisa förändringar i fluorescensintensiteten hos shuttle-GFP, som ligger i kärnan. Som en följd kan en Michaelis-Menten-liknande mättnadskurva för fluorescens-till-tiden-axeln, som representerar mängden nukleär shuttle-GFP vid vilken tidpunkt som helst, göras. Genom att använda den initiala linjära kurvhastigheten är det möjligt att generera en lutning, vilken representerar inmatningshastigheten i kärnan före fluorescensmättnad.
För att validera analysen, översättD C9orf72 dipeptidrepetitioner, poly (GR) och poly (PR), vilka tidigare har rapporterats för att störa nukleocytoplasmisk transport, användes 5 , 7 , 8 , 10 , 12 . Med hjälp av denna analys observerades en 50% minskning av nukleär importhastighet jämfört med kontrollen. Med hjälp av detta system kan små förändringar i nukleocytoplasmisk transport undersökas. Dessutom kan förmågan hos olika faktorer att rädda en nukleocytoplasmisk transportdefekt bestämmas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll demonstrerar en mycket känslig och kvantitativ ny analys för att utvärdera små förändringar i nukleocytoplasmisk transport. Med detta system är det möjligt att observera och mäta nukleocytoplasmisk transport och dess dysfunktion i realtid, inte bara stora defekter som resulterar i dramatiska förändringar i proteinfördelning. Denna analys har inte bara en känslighetsfördel, men det kräver också lite förberedelse, är billigt och är en mycket enkel och låg engagemangsanalys.
<p class…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar alla medlemmar av AI-laboratoriet för deras hjälpsamma kommentarer och förslag. Vi skulle vilja tacka professor Mark Hipp (Max Planck Institute for Biochemistry) för att ge oss shuttle-GFP-vektorn. Detta arbete stöddes av bidrag från den israeliska vetenskapsstiftelsen (ISF # 124/14), Binational Science Foundation (BSF # 2013325), FP7 Marie Curie Career Integration Grant (CIG # 333794) och National Institute for Psychobiology in Israel NIPI # b133-14 / 15).
Materials
| Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34) | tebu-bio | CLU140-A |
| DMEM 4.5g/L L-glucose | Biological Industries | 01-055-1A |
| FBS European Grade | Biological Industries | 04-007-1A |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 |
| Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3111 |
| Cover glass 12mm dia. thick 0.13-0.17mm | Bar Naor LTD | |
| TurboFect Transfection Reagent | Thermo Scientific | R0531 |
| Axiovert 100 inverted microscope | Zeiss | |
| IMAGING WORKBENCH 2 | Axon Instruments | |
| Leptomycin B | Sigma | L2913 |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A |
| Homogenizer motor/control/chuck/90-degree clamp | Glas-Col | 099C K5424CE |
| MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002455 |
References
- Alberts, B. . Molecular biology of the cell. , (2002).
- Freitas, N., Cunha, C. Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins. Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).
- Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. E. A short amino acid sequence able to specify nuclear location. Cell. 39, 499-509 (1984).
- la Cour, T., et al. Analysis and prediction of leucine-rich nuclear export signals. Protein Eng Des Sel. 17, 527-536 (2004).
- Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Sci Rep. 6, 20877 (2016).
- Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 129-133 (2015).
- Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).
- Kwon, I., et al. Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells. Science. 345, 1139-1145 (2014).
- Rossi, S., et al. Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS. J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).
- Shi, K. Y., et al. Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
- Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 56-61 (2015).
- Zhang, Y. J., et al. C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins. Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).
- Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).
- DeJesus-Hernandez, M., et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron. 72, 245-256 (2011).
- Renton, A. E., et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron. 72, 257-268 (2011).
- Boeve, B. F., et al. Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72. Brain. 135, 765-783 (2012).
- Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).
- Woerner, A. C., et al. Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA. Science. 351, 173-176 (2016).
- Tao, Z., et al. Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity. Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).
- Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84, 1213-1225 (2014).
