Detta protokoll beskriver isolering och odling av blandade murina små tarmceller. Dessa primära intestinala kulturer möjliggöra undersökning av signalvägar underliggande tarmen peptidsekretion genom att använda ett antal tekniker.
Tarmen är den största endokrina organ i kroppen, med hormonutsöndrande enteroendocrine celler belägna utmed längden av det gastrointestinala epitelet. Trots deras fysiologiska betydelse enteroendocrine celler utgör endast en liten del av epitelceller befolkningen och i det förflutna, har deras karakterisering presenteras en stor utmaning som resulterar i ett beroende av cellinje modeller. Här ger vi ett detaljerat protokoll för isolering och odling av blandade murina små tarmceller. Dessa primära kulturer har använts för att identifiera de signalvägar som ligger bakom stimulering och inhibering av tarmpeptidsekretion som svar på ett antal näringsämnen och neuropeptider samt farmakologiska medel. Vidare, i kombination med användningen av transgena fluorescerande reporter möss, har vi visat att dessa primära kulturer blivit ett kraftfullt verktyg för undersökning av fluorescerande-taggade enteroendocrine celler vid itracellular nivå, med användning av metoder såsom fläckklämning och encelliga kalcium och cAMP-FRET avbildning.
Det övergripande målet med denna metod är att isolera och kultur blandade murina tarmceller för att möjliggöra studier av tarmpeptidsekretion och levande cell imaging av enteroendocrine celler. En tidig version av detta förfarande publicerades ursprungligen 2008 av Reimann et al. 1 och har sedan legat till grund för ytterligare 20 publikationer från vår grupp. För detta manuskript, valde vi att fokusera på små tarm kulturer eftersom de är svårare att fastställa än kolon kulturer.
Enteroendocrine celler utsöndrar en array av tarmpeptider inklusive glukagonliknande peptid 1 (GLP-1), glukosberoende insulinotropisk peptid (GIP), kolecystokinin (CCK) och peptid YY (PYY) 2. Dessa gut peptider har viktiga fysiologiska roller i iscensätta postprandial svar såsom det långsammare tarm transitering, potentiering av glukosstimulerad insulinfrisättning och induktion av mättnad. GLP-1-mimetika and läkemedel som inhiberar dess nedbrytning närvarande godkänt för behandling av typ 2-diabetes och det finns pågående bedömning av den terapeutiska potentialen att stimulera den endogena sekretionen av denna peptid 3. En bättre förståelse av enteroendokrina fysiologi och de mekanismer genom vilka utsöndring är antingen stimulerade eller hämmade är därför av avgörande betydelse.
Gut peptidsekretion kan studeras med hjälp av olika in vitro- och ex vivo experimentella modeller, var och en med fördelar och nackdelar (för en omfattande senaste omdömet också täcker användningen av in vivo-modeller se Svendsen et al. 4). Ex vivo-tekniker såsom de isolerade perfuserade tarm 5 och Ussing kamrarna 6 används för närvarande för att utforska gut peptidsekretion som svar på olika ämnen. Den största fördelen med dessa metoder, somjämfört med primära kulturer är att den omedelbara omgivningen av de enteroendocrine cellerna förblir i stort sett intakt och viktigare, är polariteten hos cellerna bevaras. Därför är det möjligt att få fram information om vilka cellytan en sekretagog verkar på sex. Men dessa är vanligtvis lågt genomströmning tekniker och kvaliteten på de data som härrör från dem är starkt beroende av integriteten och viabiliteten hos tarmvävnaden, vilket oundvikligen minskar över tiden.
Tarm organoids nu alltmer används som in vitro-modeller för studier av enteroendokrina cellernas funktion och utveckling 7. Organoids, som kan härledas från både murina och humanvävnad, har fördelen att bilda 3D 'crypt-liknande' strukturer som upprätthåller cell polaritet i kultur. Emellertid organoid härledda enteroendocrine celler har ännu inte fullständigt karakteriserade och deras likhet med nativ L-cells är i stort sett okända. Primära kulturer har fördelen av att vara ett steg närmare den fysiologiska inställning, som enteroendocrine cellerna inte upprätthålls och differentieras i artificiella förhållanden under längre tidsperioder.
En alternativ primär kultur metod som har använts för bedömning av tarmpeptidsekretion är isoleringen av fetala rått intestinala celler (FRICs) 8. Emellertid har den kultur av vuxna tarmvävnad träffade mindre framgång och vissa skillnader har observerats i mottagligheten hos FRICs vs. vuxna murina tarmceller (t ex glukos 8).
Enteroendocrine liknande cellinjer (t.ex. GLUTag, STC-1 och NCI-H716) har traditionellt använts för att särskilja direkt vs. indirekta effekter på enteroendocrine celler och att dissekera underliggande molekylära mekanismer som kopplar stimulera utsöndring; se Kuhre m.fl. </em>. 9 för peptidproduktion och utsöndring av 'L celliknande' odödliggjorda cellinjer. Detta har varit nödvändigt eftersom enteroendocrine celler, utspridda längs mag-tarmkanalen, utgör knappt 1% av intestinala epitelceller 10 och sorteras celler, i våra händer, inte överlever i kultur 1. Cellinjer förblir användbara verktyg på grund av det faktum att de är en till stor del homogen cellpopulation, som är gynnsam för genetiska manipulationer såsom gentystande. Följaktligen är det lätt att undersöka rollen av proteiner som inte kan riktas farmakologiskt när transgena möss är inte tillgängliga. Men cellinjer är inte alltid giltiga modeller av primära celler. Medan det finns många likheter, fynd från primära kulturer har ibland markerade skillnader i de signalvägar som aktiveras av vissa näringsämnen i primära L-celler jämfört med GLUTag-celler, till exempel (t ex. Peptoner <sup class = "xref"> 11). Avgörande, i kombination med transgena fluorescerande reporter möss, gör det möjligt för primär kultur modell ingående granskning av enskilda primär enteroendocrine celler vid den intracellulära nivån. Fluorescensetikette L-celler inom primära kulturer har använts av vår grupp för patch fastspänning 1, 12 studier, och encelliga kalcium 11, 13 och cykliskt adenosinmonofosfat-FRET avbildning 14 studier, som har gett betydande framsteg inom området för enteroendokrina fysiologi.
Följande protokoll är optimerad för att utföra utsöndringsexperiment, med användning av en 24-brunnsplatta eller för framställning av upp till 16 avbildnings rätter, från en 10 cm sektion av tunntarmen från en enda vuxen mus. Protokollet kan lätt modifieras för studiet av kolonceller genom att öka uppslutningstider samt collagenase koncentration.
Detta protokoll beskriver isolering och odling av blandade murina små tarmceller för att möjliggöra studier av tarmpeptidsekretion och enkelcell avbildning av märkta enteroendocrine celler.
För att öka sannolikheten av de små tarm kulturer vara framgångsrika, är det viktigt att protokollet genomförs så snabbt som möjligt (helst inom 3 h från skörd av vävnad) och att vävnaden hålles i is-kallt medium eller buffert före till uppslutningsprocessen, för att begränsa celldöd. Även om det inte är nödvändigt, särskilt för kolon kulturer är avlägsnande av muskellagret från tunntarmen uppmuntras starkt. Tunntarmens kultur protokoll har standardiserats så mycket som möjligt. Det är dock viktigt att notera att ingen rötningen är identiska. Det finns många steg under detta protokoll där variabilitet kan införas på en dag till dag, t.ex. graden av muskel borttagning, storleken på than 'malet' vävnadsbitar, styrkan i skakning, potensen hos en viss sats av kollagenas osv. Det är därför, av största vikt för att inspektera alikvoter av var och en av de olika 'digests' under mikroskop för att bedöma utvecklingen av rötningsprocessen och skräddarsy skakning och antalet 'digere' i enlighet därmed. Det rekommenderas att skaka mer försiktigt till att börja med, och om crypt fragment inte är uppenbara från 'smälta' 3 och framåt, för att börja skaka mer kraftfullt.
Från vår erfarenhet, inte enteroendocrine cellerna inte förökar sig i kultur och vanligtvis försvinner från små tarm kulturer inom 4 dagar. Icke desto mindre, ger detta gott om tid att utföra tarmpeptidsekretionsexperiment (genomföres typiskt över 2 h, 18-24 h efter plätering) för att testa fysiologiska stimuli och / eller farmakologiska medel. Experiment som kräver en inkubation över natten före utsöndringen experimentet är också möjliga, t.ex.i fallet med förbehandling med pertussistoxin 15.
Den primära tekniken kulturen presenteras här är en väl etablerad metod, vilket framgår av volymen av forskningsresultaten har producerat genom åren. Primärkulturen modell har använts för att studera utsöndringen av en mängd olika tarmpeptider, inklusive GLP-1 1, GIP 18 och PYY 19, som svar på varierande näringsämnen och icke-närings 14, 20 stimuli och hämmare. Vidare har samma teknik med framgång tillämpas på odling av humana intestinala celler 21. Ofta, en kombination av den primära cellodlingsmetod tillsammans med ytterligare en experimentmodell t.ex.. ex vivo eller in vivo kan ge den mest insikt 6. Noterbart och till skillnad från andra metoder, har denna teknik imtig applikationer utöver mätningen av tarmen peptidfrisättning. Vi har visat att primära tunntarms kulturer härledda från transgena reporter möss är kraftfulla verktyg för förhör av intracellulära signaleringsvägar är kopplade till gut peptidsekretion, med användning av exempelvis Ca2 + och cAMP-sensorer, GCaMP3 11, 13 och Epac2camps 14, respektive, såväl som elektrofysiologiska tekniker 12.
Som med alla in vitro-modeller, de primära intestinala kulturer har vissa inneboende begränsningar, inkluderande minskning av polariteten hos epitelceller i odling, samt förlust av försörjning och innervation blod. Det är svårt att uppskatta de potentiella effekterna av dessa konstgjorda villkor enteroendokrina cellfunktion. Dock har data som erhållits från primära kulturer ofta varit översättnings i in vivo Setting (t ex effekter av kortkedjiga fettsyror på GLP-1-utsöndring 15).
De primära intestinala kulturer är en mångsidig teknik med många potentiella tillämpningar. De har redan gett viktiga mekanistiska inblick i regleringen av tarmpeptidsekretion.
The authors have nothing to disclose.
GLP-1 immun-analyser utfördes av Core biokemisk analys Laboratory vid Addenbrooke sjukhus.
Detta arbete har under årens lopp fått stöd av Wellcome Trust (för närvarande aktiva bidrag 106.262 / Z / 14 / Z och 106263 / Z / 14 / Z) och Medical Research Council (MRC) (bidrag MRC_MC_UU_12012 / 3 och MRC_MC_UU_12012 / 5).
24-well plates | Costar | 3524 | For secretion experiments |
Bombesin | Sigma-Aldrich | B4272 | Positive control (calcium imaging experiment) |
Centrifuge tubes, 15 ml, sterile | Greiner bio-one | 188261 | For tissue preperation/ digestion |
Centrifuge tubes, 50 ml, sterile | Corning | 430828 | For tissue preperation/ digestion |
Collagenase XI (Crude) | Sigma-Aldrich | C9407 | For making up digestion medium |
Dichroic mirror | Cairn Research | – | For imaging experiments |
DMEM High glucose (4500 mg) | Sigma-Aldrich | D6546 | For dissolving matrigel (keep at 4 oC). For making up digestion medium, pre-warm to 37 oC. |
Emission Filter (Bandwidth 510-560 nm) | Cairn Research | – | For imaging experiments |
Foetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | For making up culture medium |
Forceps/Tweezers | Agar Scientific | AGT520 | For dissection/removal of intestine |
Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | Positive control (secretion experiment) |
Glass-bottomed dishes (35 mm) | MatTek | P35G-0-14-C | For imaging experiments |
High precision tweezer (110 mm) | IDEAL-TEK | 3480641 (5 SA) | For removing muscle layer |
High resolution digital CCD camera | Hamamatsu | ORCA-ER | For imaging experiments |
3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Positive control (secretion experiment) |
L-15 Medium (Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L1518 | For collecting tissue, keep on ice |
L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For making up culture medium |
Matrigel | Corning | 354234 | Basement Membrane Matrix, for coating plates and dishes |
MetaFluor | Molecular Devices (supplied by Cairn Research) | – | Fluorescence ratio imaging software |
Mice (C57BL6) | Charles River Laboratories | C57BL/6J | Background mice used for breeding. Can also be used for secretion experiments |
Mice (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3) | in house | – | For calcium imaging and secretion experiments |
Microscope (EVOS XL Core) | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | For photomicrographs of cultures |
Microscope | Olympus | IX71 | Inverted microscope with 40x oil objective used for imaging experiments |
Monochromator | Cairn Research | – | For imaging experiments |
Pasteur pipettes | Alpha Laboratories | LW4234 | For cleaning tissue |
PBS containing Ca2+ and Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8662 | For washing tissue, keep on ice |
Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | For making up culture medium |
Petri dishes (100 mm x 20 mm) | Corning | CLS430167 | For cleaning tissue and removing muscle layer |
Potassium chloride | Fisher Scientific | P/4280/53 | Positive control (calcium imaging experiment) |
Scissors | Agar Scientific | AGT554 | For dissection/removal of intestine |
Sterile cell strainer 100 µm | Fisher Scientific | 22363549 | For filtering crypt cell suspension prior to plating |
Surgical scalpel blade No.22 (sterile, stainless) | Swann Morton | 0308 | For dicing tissue |
Syringe filters, Minisart NML (0.2 µm pore size) | Sartorius | 16534-K | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
Syringes, 20 ml, disposable, sterile, Luer slip | BD | 300613 | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
Xenon arc lamp 75W | Cairn Research | – | For imaging experiments |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | ROCK inhibitor, prepare 10 mM stock solution in sterile water (use 1:1000 in final culture medium) |