التحليل الفينوتي لطفيليات الملاريا القوارض غير الجنسية ومراحل الدم الجنسي ومراحل البعوض

Summary

ونظرا لأوجه التشابه اللافتة للنظر في دورة الحياة وبيولوجيا طفيليات الملاريا القوارض وطفيليات الملاريا البشرية، أصبحت نماذج الملاريا القوارض لا غنى عنها لبحوث الملاريا. وفي هذا الشأن، قمنا بتوحيد بعض أهم التقنيات المستخدمة في التحليل الفينوتي للأنواع البرية والمعدلة وراثيا من الملاريا القوارض.

Abstract

وقد عززت التطورات الأخيرة في علم الوراثة وتكنولوجيات بيولوجيا النظم فهمنا لبيولوجيا طفيليات الملاريا على المستوى الجزيئي. ومع ذلك، لا تزال الأهداف الفعالة لطفيليات الملاريا لتطوير اللقاحات والعلاج الكيميائي محدودة. ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى عدم توافر نماذج العدوى ذات الصلة والعملية في الجسم الحي لأنواع البلازموديوم البشرية، وأبرزها بالنسبة لP. falciparum و P. vivax. ولذلك، استخدمت أنواع الملاريا القوارض على نطاق واسع كبديل عملي في نماذج الجسم الحي للقاح الملاريا، واستهداف الأدوية، والاستجابة المناعية، ودراسات التوصيف الوظيفي للبلازموديومسب المحفوظة. وفي الواقع، أثبتت نماذج الملاريا القوارض أنها لا تقدر بثمن، ولا سيما لاستكشاف انتقال البعوض وبيولوجيا مرحلة الكبد، وكانت لا غنى عنها لإجراء دراسات مناعية. ومع ذلك، هناك اختلافات في الأساليب المستخدمة لتقييم الأنماط الظاهرية للطفيليات غير الجنسية والجنسية في مرحلة الدم. ومن الأمثلة على هذه الاختلافات اختيار العدوى الوريدية مقابل العدوى داخل تبواق القوارض مع طفيليات مرحلة الدم وتقييم الإثارة بين الذكور. هنا، نقوم بتفصيل الطرق التجريبية الموحدة لتقييم الأنماط الظاهرية لمراحل الدم غير الجنسي والجنسي في الطفيليات المعدلة وراثيا التي تعبر عن أنواع طفيليات الملاريا من نوع المراسل أو البرية من نوع القوارض. كما نقوم بتفصيل طرق تقييم الأنماط الظاهرية لمراحل البعوض الطفيلي ة (الجاميتس، أوكينيتس، أوكيستس، وسبوروزويتس) داخل ناقلات البعوض الأنوفيليس. هذه الأساليب مفصلة ومبسطة هنا للسلالات القاتلة وغير الفتاكة من P. berghei و P. yoelii ولكن يمكن أيضا أن تطبق مع بعض التعديلات على P. chabaudi و P. vinckei القوارض الملاريا الأنواع.

Introduction

تسبب طفيليات الملاريا مئات الملايين من الإصابات بالملاريا بين البشر في جميع أنحاء العالم، مع أكثر من 600،000 حالة وفاة كل عام¹. تحدث العدوى البشرية من قبل خمسة أنواع طفيلية الملاريا، وهي P. falciparum، P. vivax، P. ovale، P. malariae،و P. knowlesi. معظم الوفيات السريرية الناجمة عن الملاريا سببها P. falciparum في أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى¹. وهناك نوع آخر من أنواع طفيليات الملاريا البشرية التي تسبب أمراضا واسعة النطاق في جميع أنحاء العالم خارج أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى هو P. vivax². الأنواع الثلاثة الأخرى كلها مقيدة جغرافيا أكثر وتتسبب في التهابات الملاريا الحميدة، باستثناء P. knowlesi^{القاتلة 3}. إن عدم توافر نماذج العدوى غير البشرية ذات الصلة والعملية في الجسم الحي كان ولا يزال يشكل عقبة أمام تطوير لقاحات الملاريا والأدوية. وقد اعتمدت في وقت سابق استهداف أدوية الملاريا والدراسات الأيضية على نطاق واسع على نماذج الملاريا الطيور مثل P. gallinaceum و P. lophurae, تصيب الدجاج والبط, على التوالي⁴. وبعد ذلك، أدخلت أنواع الملاريا القوارض تدريجيا في مختلف اللقاحات والدراسات التي تستهدف المخدرات كما هو الحال في نماذج الجسم الحي. وعلى مر السنين، تراكمت الأدلة على أوجه التشابه بين البيولوجيا والتفاعلات بين الطفيليالمضيف والطفيليات في مراحل دورة حياة نماذج الملاريا القوارض لأنواع الملاريا البشرية.

وعلى وجه الخصوص، كانت نماذج الملاريا القوارض بالغة الأهمية لاستكشاف وتوصيف بيولوجيا البعوض والمراحل السابقة للحريثوسير⁵. ومع ذلك، هناك أربعة أنواع الملاريا القوارض(P. berghei، P. yoelii، P. chabaudi، و P. vinckei) التي لها سمات بيولوجية مختلفة ، وأبرزها في مراحل الدم⁶. تختلف أنواع الملاريا القوارض في تزامن مراحل الدم، حيث مراحل الدم من سلالات P. chabaudi و P. vinckei متزامنة في الغالب، في حين أن مراحل الدم من P. berghei و P. yoelii ليست^{6 , 7.}وثمة فرق ملحوظ آخر هو التطهير الذاتي لمراحل الدم التي تحدث في بعض السلالات (علىسبيلالمثال، P. yoelii 17X-NL، P. berghei NK65، و P. vinckei lentum)،في حين أن عدوى الدم من غيرها سلالات من نفس النوع يمكن أن تكون قاتلة إذا تركت دون علاج(P. yoelii 17X-L, P. berghei ANKA, و P. chabaudi AS). وعلاوة على ذلك، P. yoelii 17X-NL سلالة وP. berghei ANKA سلالة تغزو بشكل تفضيلي reticulocytes^8،9،10،11، على الرغم من أن هذه الميزات من P. سلالات يويلي وP. berghei ليست متطلبات النمو الصارمة^12،13،14. لذلك، يتم التعامل مع الفئران مع فينيل هيدرازين قبل العدوى مع مراحل الدم من تلك الطفيليات لزيادة الطفيليات وgametocytemia اللازمة لعدوى البعوض لسلالة P. berghei ANKA وP. yoelii 17X-NL^{15،16،17،18،19}.

كما توجد اختلافات في مراحل البعوض بين مختلف أنواع الملاريا القوارض، وأبرزها درجة الحرارة والوقت اللازمين لتطوير مراحل البعوض الأمثل وطول السبوروزويت⁵و6، ²⁰. في المراحل ما قبل الاريثروسسية من أنواع الملاريا القوارض، وتشمل الاختلافات أنواع القوارض والإجهاد التي هي الأكثر عرضة للتلقيح sporozoite المعدية، وعدد من sporozoites اللازمة للتلقيح في سلالة القوارض عرضة، و أنواع الخلايا الثديية اللازمة لاختبارات تطوير مرحلة الكبد في المختبر، والوقت لإكمال تطور مرحلة الكبد^{5،21،22،23،24،25 ،26،27،28،29،30.}

وعلى الرغم من هذه التقلبات، كانت طفيليات الملاريا القوارض النماذج المواتية في وقت مبكر لتطبيق النهج الوراثية العكسية، لأنها كانت أقل استهلاكا للوقت والموارد مع احتمال كبير للنجاح³¹. في الواقع، كانت نماذج الملاريا القوارض أفضل النماذج، وفي كثير من الحالات النماذج الوحيدة، المتاحة لسنوات عديدة لتوصيف وظيفيا الجينات المعبر عنها في مراحل البعوض والكبد.

في ضوء شعبية وإمكانية استخدام النهج الوراثية العكسية في نماذج الملاريا القوارض، تم استخدام عدد من المنهجيات المختلفة لتحليل الأنماط الظاهرية لمراحل دورة حياة الطفيليات المعدلة وراثيا، وخاصة مراحل الدم. غير أن بعض هذه المنهجيات غير متسقة؛ على سبيل المثال، مقارنة عدوى الطفيليات في مرحلة الدم بعد حقن IP (والتي من المحتمل أن تستنزف إلى العقد الليمفاوية العبية، ومن هناك، يمكن أن تدخل مجرى الدم؛ وبالتالي، فإن الطفيليات المحقونة لا ينتهي بها المطاف بالتساوي في مجرى الدم) ، مقارنة انتقال البعوض من الحيوانات المستنسخة مع عدد مختلف من عمليات نقل مرحلة الدم التسلسلية أو رقم G (التي يمكن أن تؤثر على تكوين اللطوطوطين^32،33)، أو مقارنة الطفيليات المعدلة وراثيا مباشرة إلى النوع البري السذاجة (WT) الطفيليات التي لم تخضع أبدا للكهرباء واختيار الدواء الإيجابي ومختلف التقييمات غير الموحدة من اللجام الذكور exflagellation. لذلك، من الأهمية بمكان توحيد البروتوكولات التي هي بسيطة لمتابعة التحليل الفينوتي لأي نوع من الطفيليات الملاريا القوارض المعدلة وراثيا أو WT في الدم وفي البعوض لاستيعاب التغيرات البيولوجية لملاريا القوارض أنواع الطفيليات.

هنا، نحن تقرير عن موحدة، بروتوكول تجريبي مفصل لتحليل فينوتيبيك من مراحل دورة حياة الدم والبعوض من الطفيليات المعدلة وراثيا أو البرية من نوع P. yoelii و P. berghei . وتنطبق هذه البروتوكولات أيضا على الطفيليات P. chabaudi و P. vinckei.

Protocol

وقد أجريت جميع التجارب الحيوانية الموصوفة هنا وفقا للبروتوكولات المعتمدة للجنة الرعاية والاستخدام الحيوانية المؤسسية (IACUC) من جامعة تولين ولجنة أخلاقيات الحيوانات في جامعة بزاميليم فاكيف. وقد أجريت جميع البروتوكولات التجريبية الأخرى واستخدام الحمض النووي المؤتلف وفقا للبروتوكولات الم…

Representative Results

وقد أحدث نجاح تطبيق الأدوات والتقنيات الوراثية العكسية على طفيليات الملاريا ثورة في مجال بحوث الملاريا، مع القدرة على إضافة أو حذف أو تعديل أجزاء جينية محددة من عدة أنواع من البلازموديوم 39. والأهم من ذلك، تم تحديد موضع الجينوم القابل للصرف واستخدامه بن…

Discussion

وعلى الرغم من التشابه في البيولوجيا العامة لدورات حياتها مع الطفيليات البشرية بالملاريا، فإن نماذج الملاريا الفأرة لها أيضا ً العديد من أوجه الاختلاف مع أنواع البلازموديوم البشرية التي من شأنها أن تحد من استخدامها على أنها موثوقة في نماذج الجسم الحي. فعلى سبيل المثال، وباستثنا…

Materials

Heparin	Sigma	375095-100KU
Xanthurenic acid	Sigma	D120804-5G
Hypoxanthine	Sigma	H9377-25G
Alsever's solution	Sigma	A3551-500ML
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761-500G
Phenylhydrazine	Sigma	P26252-5G
Glycerol	Sigma	G5516-500ML
Giemsa	Sigma	GS1L-1L
26G x 3/8 Precision Glide Needle,	Becton Dickinson	305110
1 ml TB Syringe, 26G x 3/8	Becton Dickinson	309625
1 cc Insulin Syringe, U-100 27G	Becton Dickinson	329412
Isoflurane, USB	Piramal	2667- 46- 7
PBS, pH 7.4	Gibco	10010049
RPMI	Gibco	22400105
DMEM	Gibco	11995065
Pencillin/ Streptomycin	Gibco	10378016
Fetal Bovine Serum	Gibco	10082147
Fiber Glass Wool	Corning	3950