Fenotypiske analyse av gnager malaria parasitt aseksuell og seksuelle blodprøver og Mosquito stadier

Summary

På grunn av den slående likheter i livssyklusen og biologi av gnager malariaparasitter til menneskelig malariaparasitter, gnager malaria modeller har blitt uunnværlig for malaria forskning. Her standardiserte vi noen av de viktigste teknikkene som brukes i fenotypiske analyse av vill-type og transgene gnager malaria arter.

Abstract

Nylige fremskritt innen genetikk og systemer biologi teknologi har fremmet vår forståelse av biologi av malariaparasitter på molekylnivå. Imidlertid er effektiv malaria parasitt mål for vaksine og kjemoterapi utvikling fortsatt begrenset. Dette skyldes i stor grad utilgjengelighet av relevante og praktiske in vivo infeksjon modeller for menneskelig Plasmodium arter, særlig for p. falciparum og p. vivax. Derfor gnager malaria arter har blitt mye brukt som praktisk alternativ in vivo-modeller for malaria vaksine, narkotika målretting, immunrespons, og funksjonell karakterisering studier av bevarte Plasmodiumspp. gener. Faktisk, gnager malaria modeller har vist seg å være uvurderlig, spesielt for å utforske mygg overføring og lever scenen biologi, og var uunnværlig for immunologiske studier. Det er imidlertid avvik i metodene som brukes til å evaluere fenotyper av transgene og vill-type aseksuell og seksuelle blod-scene parasitter. Eksempler på disse avvikene er valget av en intravenøs vs. intraperitoneal infeksjon av gnagere med blod-scene parasitter og evalueringen av mannlig Kjønnscelle exflagellation. Heri, vi detalj standardiserte eksperimentelle metoder for å evaluere fenotyper av aseksuell og seksuelle blod stadier i transgene parasitter uttrykker reporter-genet eller vill-type gnager malaria parasitt arter. Vi har også detalj metodene for å evaluere fenotyper av malaria parasitten mygg stadier (kjønnscellene, ookinetes, oocyster, og sporozoitter) inni Anopheles Mosquito vektorer. Disse metodene er detaljert og forenklet her for dødelige og ikke-dødelige stammer av p. berghei og p. yoelii men kan også brukes med noen justeringer til p. chabaudi og p. vinckei gnager malaria arter.

Introduction

Malaria parasitter forårsake hundrevis av millioner av malaria infeksjoner hos mennesker over hele verden, med mer enn 600 000 dødsfall hvert år¹. Menneskelige infeksjoner er forårsaket av fem malaria parasitt arter, nemlig p. falciparum, p. vivax, p. ovale, p. malariae, og p. knowlesi. De fleste kliniske malaria dødelighet er forårsaket av P. falciparum i Afrika sør for Sahara¹. En annen menneskelig malaria parasitt arter som forårsaker omfattende verdensomspennende morbidities utenfor Afrika sør for Sahara er P. vivax². De tre andre artene er mer geografisk begrenset og forårsake godartet malaria infeksjoner, bortsett fra den dødelige P. knowlesi³. Utilgjengelighet av relevante og praktiske ikke-menneskelige in vivo modeller av infeksjoner har alltid vært og er fortsatt et hinder for malaria vaksine og narkotika utvikling. Tidligere malaria narkotika målretting og metabolske studier har støttet seg mye på avian malaria modeller som p. gallinaceum og p. lophurae, infiserer kyllinger og ender, henholdsvis⁴. Deretter ble gnagere malaria arter gradvis innført i ulike vaksiner og narkotika målretting studier som in vivo-modeller. Gjennom årene, bevis på likheter av biologi og Host-parasitt interaksjoner av livssyklus stadier av gnager malaria modeller for menneskelig malaria arter har akkumulert.

Spesielt gnager malaria modeller var svært viktig å utforske og karakterisere biologi av mygg og pre-erythrocytisk etapper⁵. Men det er fire gnager malaria arter (p. berghei, p. yoelii, p. chabaudi, og p. vinckei) som har ulike biologiske egenskaper, den mest bemerkelsesverdige av dem er i blodprøvene⁶. Gnagere malaria arter varierer i synkron av blod stadier, der blod stadier av p. chabaudi og p. vinckei stammer er for det meste synkron, mens blodprøvene av p. berghei og p. yoelii er ikke^{6 , 7}. en annen merkbar forskjell er selv-clearance av blod stadier som oppstår i enkelte stammer (f. eks, p. Yoelii 17X-nl, P. berghei NK65, og P. vinckei lentum), mens blod smitte av andre stammer av samme art kan være dødelig hvis venstre ubehandlet (P. yoelii 17X-L, P. berghei ANKA, og P. chabaudi AS). Dess, p. yoelii 17X-nl belastning og P. berghei ANKA stamme fortrinnsvis invadere retikulocytter^8,9,10,11, selv om disse funksjonene i P. yoelii og P. berghei stammer er ikke en streng vekst krav^12,13,14. Derfor er mus behandlet med phenylhydrazine før en infeksjon med blod stadier av disse parasitter for å øke parasitemia og gametocytemia nødvendig for en mygg infeksjon for p. berghei ANKA belastning og for p. yoelii 17X-nl^{15,16, 17,18,19}.

Forskjeller i mygg stadier utvikling finnes også blant ulike gnager malaria arter, den mest bemerkelsesverdige er temperaturen og tiden som kreves for optimal mygg stadier utvikling og sporozoite lengde^5,6, og ²⁰. I pre-erythrocytisk stadier av gnager malaria arter, forskjellene inkluderer gnagerarter og belastning som er mest utsatt for smittsomme sporozoite inoculation, antall sporozoitter nødvendig for inoculation i en utsatt gnager belastning, pattedyr celletyper som trengs for in vitro Liver stadium utvikling analyser, og tid til å fullføre leveren stadium utvikling^{5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30}.

Til tross for disse variabilitet, gnager malariaparasitter var de gunstige modellene tidlig for anvendelsen av omvendte genetiske tilnærminger, fordi de var mindre tid-og ressurskrevende med en høy sannsynlighet for å lykkes³¹. Faktisk gnager malaria modeller var de beste modellene, og i mange tilfeller de eneste modellene, tilgjengelig for mange år til funksjonelt karakterisere gener uttrykt i mygg og lever etapper.

I lys av populariteten og amenability av omvendte genetiske tilnærminger i gnagere malaria modeller, har en rekke ulike metoder blitt benyttet for å analysere fenotyper av transgene parasitten livssyklus stadier, spesielt blod stadier. Noen av disse metodene er imidlertid inkonsekvente. for eksempel, sammenligne infeksjoner av blod-scenen parasitter etter en IP-injeksjon (som er muligens drenert til bukhulen, og derfra kan gå inn i blodet; derfor er injisert parasitter ikke ende opp like i blodet) , sammenligner mygg overføring av kloner med et annet antall serie blod-scene overføringer eller G-nummer (som kan påvirke gametocytogenesis^32,33), eller sammenligne transgene parasitter direkte til naiv vill-type (WT) parasitter som aldri ble utsatt for electroporation og positivt legemiddel valg og de ulike unstandardized evalueringer av mannlig Kjønnscelle exflagellation. Derfor er det avgjørende å standardisere protokoller som er enkle å følge for fenotypiske analyse av enhver type transgene eller WT gnager malariaparasitter i blodet og i myggen å imøtekomme for biologisk variabilitet av gnager malaria parasitten arter.

Heri, rapporterer vi om en standardisert, detaljert eksperimentell protokoll for fenotypiske analyse av blod og mygg livssyklus stadier av transgene eller vill-type P. yoelii og P. berghei parasitter. Disse protokollene gjelder også for p. chabaudi og p. vinckei parasitter.

Protocol

Alle dyr eksperimenter beskrevet her ble gjennomført i henhold til godkjente protokoller av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) av Tulane University og dyrene etikk komiteen Bezmialem Vakif University. Alle andre eksperimentelle protokoller og bruk av rekombinant DNA ble gjennomført i henhold til godkjente protokoller av institusjonelle biosafety Committee (IBC) av Tulane University. 1. infeksjon av mus med blod-Stage parasitter for Parasitemia analyse og Mosquito infeksjon an…

Representative Results

Suksessen med å anvende omvendt genetiske verktøy og teknikker for å malariaparasitter har revolusjonert feltet av malaria forskning, med mulighet til å legge til, slette eller endre bestemte genomisk segmenter av flere Plasmodium arter39. Viktigere, unnværlig genomisk Loci har blitt identifisert og brukt med hell å innføre fluorescens protein markører i gnager og menneskelig malariaparasitter ved dobbel homologe rekombinasjon, for å sikre et stab…

Discussion

Til tross for likheten i den generelle biologi av deres liv sykluser til at av menneskelig malariaparasitter, mus malaria modeller har også mange dissimilarities til menneskelige Plasmodium arter som ville begrense bruken som pålitelig in vivo -modeller. For eksempel, med unntak av Live-dempes parasitter som vaksiner, alle vaksine studier med delenhet og DNA og andre vaksiner ga gode resultater i muse modellen, men hos mennesker som bor i endemiske områder, resultatene var langt fra tilfredsstillende…

Materials

Heparin	Sigma	375095-100KU
Xanthurenic acid	Sigma	D120804-5G
Hypoxanthine	Sigma	H9377-25G
Alsever's solution	Sigma	A3551-500ML
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761-500G
Phenylhydrazine	Sigma	P26252-5G
Glycerol	Sigma	G5516-500ML
Giemsa	Sigma	GS1L-1L
26G x 3/8 Precision Glide Needle,	Becton Dickinson	305110
1 ml TB Syringe, 26G x 3/8	Becton Dickinson	309625
1 cc Insulin Syringe, U-100 27G	Becton Dickinson	329412
Isoflurane, USB	Piramal	2667- 46- 7
PBS, pH 7.4	Gibco	10010049
RPMI	Gibco	22400105
DMEM	Gibco	11995065
Pencillin/ Streptomycin	Gibco	10378016
Fetal Bovine Serum	Gibco	10082147
Fiber Glass Wool	Corning	3950